みにれびゅう

細菌小分子RNAの機能構造と生合成

森田 鉄兵

鈴鹿医療科学大学薬学部薬学科 ◇ 〒513–8670　三重県鈴鹿市南玉垣町3500–3

1. はじめに

遺伝子からmRNAを経てタンパク質へと情報変換される過程（遺伝子発現）は，細胞を取り巻く環境，あるいは細胞の状態の変化に応答して制御される．代表的な遺伝子発現の制御因子は，転写開始の制御を担う転写因子（タンパク質）である．その一方で，近年の研究から，RNAも制御因子として機能し，遺伝子発現を制御することが明らかになった．小分子RNA（small RNA：sRNA）は代表的な遺伝子発現の制御因子であり，原核生物から高等真核生物に至るまで，ほとんどの生物においてその存在が確認されている．このため，転写因子による制御と同様に，sRNAによる制御は普遍的な遺伝子発現制御であると考えられる．

主にグラム陰性菌において，Hfqタンパク質を介して機能するsRNAが存在する（これより以下，sRNAはHfq結合型sRNAを示す）．sRNAによる遺伝子発現制御のメカニズムは，主に大腸菌，サルモネラ菌において解析が進められてきた．sRNAは，Hfqの補助により標的にするmRNAと塩基対を形成し，mRNAの翻訳，および安定性を調節することにより遺伝子発現を制御する．また，mRNAの安定性調節には，Hfqと結合するエンドリボヌクレアーゼであるRNase Eが必要である．sRNA/Hfq/RNase Eの三者複合体が標的mRNAに協調的に作用することにより，大半の標的遺伝子の発現は抑制され，一部の標的遺伝子の発現は促進される1, 2）．また，このような制御メカニズムの研究と並行して，sRNAの性質についての研究も大腸菌，サルモネラ菌において活発に行われている．本稿では，sRNAの性質，特にHfq結合領域，および生合成過程（3′末端の形成，5′-プロセシング）に関する最近の報告を紹介する．

2. Hfq結合領域はsRNAの3′領域に存在する

Hfqは，1960年代にRNAファージQβの複製に必要な宿主（大腸菌）因子（host factor Qβ phage）として同定されたタンパク質である．その後の解析により，sRNA/標的mRNA間の塩基対の形成を促進させる機能を持つことが明らかになり，ファージ感染にとどまらず，Hfqは細胞内でのsRNA制御に必要なタンパク質因子であると位置づけられている3）．断片化したRNAを用いて行われたin vitro実験系により，HfqがAUに富むRNAに優先的に結合することが示されていたが，制御に必要なsRNA上のHfq結合領域は不明であった．筆者らは，大腸菌を用いて，代表的なsRNAの一つであるSgrSの機能解析を進めることにより，Hfqとの機能的結合に十分なSgrS領域を突き止めた4, 5）．Hfq結合領域はSgrSの3′領域に位置し，3′末端の7塩基以上のポリU鎖（①），および一つ，あるいは二つのRNAヘアピン構造の直前に位置するUに富む配列（②）により構成される（図1A）．これらの要素は，ほとんどのsRNAに存在するものであり，sRNAの一般的な要素と考えることができる5）．時を同じくして，Sauerらは生物物理学的な解析により，①，②の要素が，Hfqの近位面，および側面（リム）にそれぞれ結合することを示した6, 7）（図1B）．その一方で，標的mRNA上の要素はA-R-N（Rはプリン残基，Nはすべての残基）の繰り返し配列（③）であり，③はHfqの遠位面に優先的に結合する8）（図1B）．また，一部のsRNAは②の代わりに③を保持しており，その場合には，標的mRNAには③の代わりに②が備わっている．それらは，Hfqの遠位面とリムを使い分けることで，Hfqによる対形成促進作用を受ける8）．

図1 sRNAの機能構造とHfq/sRNA/標的mRNAの結合様式

3. sRNAの発現とその制御

sRNA遺伝子は独自のプロモーターを持ち，主にストレス下において，特異的な転写因子によりそれぞれ発現が誘導される3）．グルコースリン酸の細胞内蓄積により合成が誘導されるSgrSは，グルコーストランスポーターをコードするptsG mRNAを含むいくつかのmRNAを標的にして，グルコースリン酸の蓄積を緩和させるように遺伝子発現を制御する9）．

タンパク質をコードする多くの遺伝子と同様に，sRNA遺伝子は，末尾にRho非依存転写終結領域（以下，ターミネーター）を持つ．ターミネーターは，タンパク質因子であるRho非依存的に，すなわちDNA上の配列依存的に転写を終結させる領域であり，GCに富む回文配列，およびそれに続くポリTストレッチにより構成される．回文配列の転写により合成された新生RNA鎖がヘアピン構造を形成すると，ヘアピン構造はRNAポリメラーゼの転写伸長を阻害し，ポリTストレッチ上で鋳型DNA鎖，および新生RNA鎖からRNAポリメラーゼを解離させる．

sRNAの3′領域に存在するHfq結合領域がターミネーターと重複していることから，sRNAの生合成と転写終結反応には密接な関係があると考えられる（図1A）．そこで，筆者らはsRNA遺伝子における転写終結の解析を目的として，sgrS遺伝子の直後にリボソームタンパク質をコードするrplL遺伝子のターミネーターを配置したダブルターミネーター遺伝子を構築した．これにより，一般的に検出が困難であるリードスルー産物を比較的安定に検出することが可能になる．このダブルターミネーター遺伝子を用いて解析した結果，リードスルー産物がHfqと結合しないことを確認した10）．これは，3′末端の伸長によりSgrSのHfq結合領域の位置が3′末端ではなくなったためであると考えられる（図2A）．

図2 sRNAの生合成

また，アラビノースの添加によりダブルターミネーター遺伝子の転写を誘導させるように設計し，通常下，およびストレス下における転写終結効率の比較を行ったところ，通常下に比べ，ストレス下において転写終結効率が大幅に上昇していた10）．これは，転写開始制御に加えて，sRNAの発現が転写終結においても制御されていることを示している．ゲノム上のsgrS遺伝子の下流には，糖排出トランスポーターファミリーに属するSetAタンパク質をコードするsetA遺伝子が存在し，その転写はsgrS遺伝子と同一のプロモーターで起こることが確認されている11）．その一方で，sgrS変異とは異なり，グルコースリン酸の蓄積ストレスに対するsetA変異の影響が限定的であること，またSetAがグルコースリン酸を基質にしないことが示された11）．これらのことから，ストレス下におけるsgrS遺伝子の転写終結効率の上昇には，ストレス応答に対しより効果的であるSgrSの合成量を増加させるという生物学的な意義があると考えられる．

4. 3′末端の位置決定におけるターミネーターヘアピンの役割

3′末端が伸長したリードスルー産物がsRNAとして機能しないことが明らかになった一方で，何らかの原因で3′末端が短くなった転写産物はどうだろうか．3′末端の7塩基以上のポリU鎖は，Hfqとの機能的結合に必要なsRNA領域であり，そのためほとんどのsRNA遺伝子のターミネーターには，7塩基以上のポリTストレッチが存在する5）．加えて，転写終結時に，ポリTストレッチは十分な長さのポリU鎖へと転写される必要がある．もし転写終結が早期に起こった場合には，短いポリU鎖を3′末端に持つ転写産物が合成され，これらはHfqと結合しないためsRNAとして機能しないと考えられる．

筆者らは，この可能性を検証するために，ターミネーターのヘアピン構造の熱安定性に着目し，ヘアピン構造を安定化させるように挿入変異を導入した変異sgrS遺伝子から合成される転写産物の3′末端を解析した．その結果，野生型sgrS遺伝子では，3′末端に8塩基のポリU鎖（8U）を保持する転写産物が多数合成されていたのに対して，変異sgrS遺伝子では，8Uを保持する少数の転写産物に加えて，6塩基以下のポリU鎖を保持する転写産物が多数合成されていた．また，変異sgrS遺伝子から合成されたこれらの3′末端が異常なRNAは，Hfqと結合しなかった．以上の結果は，ターミネーターのヘアピン構造の熱安定性が3′末端の位置の決定に重要な要素であることを示すとともに，sRNA遺伝子のターミネーターが，3′末端に7塩基以上のポリU鎖を備えたRNAを合成するのに適した構造を持つことを示している（図2B, Morita, T., Nishino, R., & Aiba, H., 印刷中）．

5. 5′-プロセシングにより生合成されるsRNA

一般的には転写産物がsRNAとして機能すると考えられているが，近年これらに加えて，転写産物がプロセシングされた後に，その3′領域がsRNAとして機能する例が報告されている．Chaoらは，サルモネラ菌において，転写産物の5′領域がプロセシングにより除去され，56塩基長の機能的なArcZ sRNAが合成されることを明らかにした12）（図2C）．興味深いことに，この5′-プロセシングにはHfq/RNase Eが必要である．このことから，プロセシングにより生じたsRNAがHfq/RNase Eと複合体を形成し標的mRNAを分解するという，sRNAの成熟とmRNA抑制が連動したsRNA制御機構の存在が想起される12）．この他にも，5′-プロセシングにより切り出された転写産物の3′領域がsRNAとして機能する例がいくつか報告されている13）．その一方で，3′-プロセシングにより成熟するsRNAは現在のところ見つかっていない．このことは，Hfq結合領域がターミネーターと重複する3′領域に存在することによると考えることができる．

6. おわりに

本稿において一部を紹介したように，sRNAの制御機構，および性質の大部分が明らかになりつつある．また最近では，それらをもとに解析が進められ，生物現象に関わるsRNA制御の研究は広がりを見せている．中でも，宿主（ショウジョウバエ）貪食作用に対する細菌（大腸菌）抵抗性におけるHfqの必要性を示す研究14）のように，感染症に関わるsRNA制御は医学的にも重要な意義を持つ．また，Hfqホモログが存在するにも関わらず，グラム陽性菌においてはHfqに依存したsRNA制御はほとんど確認されないことも興味深い．最近，Hfqのリムを構成するアミノ酸の違いがsRNA制御の有無に関係するという報告がなされた15）．これらに加え，sRNAの要素（3′領域の配列）に着目した細菌種間での比較解析は取り組みたい研究課題である．

本稿で紹介した筆者が携わった研究は，名古屋大学大学院理学研究科，および鈴鹿医療科学大学薬学部において，饗場弘二教授のもとで行われました．共同研究者の方々に心より御礼申し上げます．

1) Morita, T. & Aiba, H. (2011) Genes Dev., 25, 294–298.

2) Papenfort, K. & Vanderpool, C.K. (2015) FEMS Microbiol. Rev., 39, 362–378.

3) Gottesman, S. & Storz, G. (2011) Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 3, a003798.

4) Otaka, H., Ishikawa, H., Morita, T., & Aiba, H. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 13059–13064.

5) Ishikawa, H., Otaka, H., Maki, K., Morita, T., & Aiba, H. (2012) RNA, 18, 1062–1074.

6) Sauer, E. & Weichenrieder, O. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 13065–13070.

7) Sauer, E., Schmidt, S., & Weichenrieder, O. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 9396–9401.

8) Schu, D.J., Zhang, A., Gottesman, S., & Storz, G. (2015) EMBO J., 34, 2557–2573.

9) Bobrovskyy, M. & Vanderpool, C.K. (2016) Mol. Microbiol., 99, 254–273.

10) Morita, T., Ueda, M., Kubo, K., & Aiba, H. (2015) RNA, 21, 1490–1501.

11) Sun, Y. & Vanderpool, C.K. (2011) J. Bacteriol., 193, 143–153.

12) Chao, Y., Li, L., Girodat, D., Forstner, K.U., Said, N., Corcoran, C., Smiga, M., Papenfort, K., Reinhardt, R., Wieden, H.J., Luisi, B.F., & Vogel, J. (2017) Mol. Cell, 65, 39–51.

13) Miyakoshi, M., Chao, Y., & Vogel, J. (2015) Curr. Opin. Microbiol., 24, 132–139.

14) Shiratsuchi, A., Nitta, M., Kuroda, A., Komiyama, C., Gawasawa, M., Shimamoto, N., Tuan, T.Q., Morita, T., Aiba, H., & Nakanishi, Y. (2016) J. Immunol., 197, 1298–1307.

15) Zheng, A., Panja, S., & Woodson, S.A. (2016) J. Mol. Biol., 428, 2259–2264.

森田 鉄兵（もりた てっぺい）

鈴鹿医療科学大学薬学部薬学科助教．博士（理学）．

略歴 ◇ 2002年名古屋大学理学部卒業，06年同大学大学院理学研究科修了，同年同助手，09年鈴鹿医療科学大学薬学部助手，16年より現職．

研究テーマと抱負 ◇ 細菌小分子RNAによる遺伝子発現制御機構．