みにれびゅう

ウイルス感染におけるスフィンゴミエリン生合成の役割

谷口 真

金沢医科大学総合医学研究所生命科学研究領域 ◇ 〒920–0293　石川県河北郡内灘町大学1丁目1番地

1. はじめに

形質膜は脂質二重層の生体膜からなり，細胞内外を隔てている．形質膜は増殖，分化，遊走，炎症応答などさまざまな細胞機能を発揮するシグナルにおいて，そのリガンド–受容体の起点となるだけでなく，エンドサイトーシスやエキソサイトーシスなどの細胞内外への物質のやりとりが行われる場所である．他方，ウイルスもこの形質膜を介して標的細胞へ吸着・侵入を行い，宿主内の機構を利用して複製・放出を繰り返し，感染を成立することでさまざまな病態を引き起こす．そのため，病態を引き起こすウイルスの生活環を理解することが予防・治療へとつながる．スフィンゴミエリン（sphingomyelin：SM）は，生体膜を構成するスフィンゴ脂質の一つであり，生体膜に存在するスフィンゴ脂質の中では最も多く存在している．このSMは形質膜をはじめとする生体膜において，散在して存在するのではなく，マイクロドメイン（脂質ラフト）と呼ばれる部分に集積している1）．近年，SMを主要因子とする脂質マイクロドメインが，先にあげた細胞機能の制御に関与することが知られており2），本稿では，生体膜SMとその合成酵素（sphingomyelin synthase：SMS）の役割について，ウイルス生活環への関与を中心として概説したい．

2. 生体膜SMとSMS

SMはセラミドとホスファチジルコリン（phosphatidylcholine：PC）を基質として，SMSによりジアシルグリセロールとともに合成される2–4）．SMSには3種類のアイソフォームSMS1, SMS2およびSMSrが存在するが，SM合成活性を有するのはSMS1およびSMS2のみであり，SMSrはセラミドホスホエタノールアミン（ceramide phosphoethanolamine：CPE）を合成することが知られている（図1）．SMS1およびSMS2も微弱なCPE合成活性を有しているが，CPEの細胞内の量はわずかであり，その機能はわかっていない．SMS1はゴルジ体，SMS2は形質膜およびゴルジ体に局在することが知られており，細胞種によってはSMS1がゴルジ体において合成するSMが細胞内産生量の大部分に寄与している報告もあるが，SMS2も関与する報告も多数あり，その機能の違いについてはいまだ不明な点が多い．形質膜を含む細胞膜SMは，ゴルジ体においてセラミドとPCから合成されたSMが各生体膜へと輸送されたものであり，ゴルジ体が主なSM産生の場だと考えられている（図1）．これまでに我々は，マウスリンパ球細胞WR19Lにおいて，SMS1が形質膜SMの産生に関与しており，SMの有無によってトランスフェリン（transferrin：Tf）およびTf受容体の細胞内動態が異なることを示した5）．形質膜SMが豊富に存在する場合には，Tf/Tf受容体はクラスリン依存性にエンドサイトーシスで取り込まれ，細胞増殖に必要な鉄分を引き渡した後，細胞外へ放出され再利用されていく．しかし，SMS1が欠失して形質膜SM量が著しく低下している場合には，Tf/Tf受容体はクラスリン非依存性に取り込まれリソソームへと向かい分解されてしまうため，細胞増殖を引き起こすことができない．また，我々は形質膜SMの外部刺激による応答に対する役割を細胞レベルで解析するために，SMS欠損マウスの胎仔から不死化線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast：MEF）を樹立した6）．SMS1およびSMS2の両方を欠損したマウスは胎生致死であるが，樹立されたMEFは，SM合成活性が完全になくなり，生体膜SMをほとんど失っている．このSMS欠損MEFでは，CXCL12ケモカインとその受容体CXCR4の応答が促進して，細胞遊走が増強されることを明らかにした6）．SMS欠損により形質膜SMが減少することで，CXCL12–CXCR4複合体が脂質マイクロドメインに集積し，エンドサイトーシスが促進されるため，下流のシグナル（ERK1/2）の活性化が増強されていた．このことから，形質膜SMがリガンド–受容体応答の場としてシグナルを制御し，細胞の運命を決定することが示唆されている．他方，生体膜SMはさまざまな細胞外刺激に応じてスフィンゴミエリナーゼ（sphingomyelinase：SMase）による加水分解によってセラミドの産生に利用され，生じたセラミドは生理活性脂質としてアポトーシスやオートファジーなどのシグナル伝達に関わっている3, 7, 8）．形質膜に局在するSMS2は，外部刺激によって失ったSMを，速やかにセラミドから再び合成することで形質膜SMの恒常性を保っていると考えられている9）．

図1 SM合成経路とSMS

3. 日本脳炎ウイルス感染と形質膜SM

日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus：JEV）は，蚊媒介性のフラビウイルス科フラビウイルス属に属する約11,000ヌクレオチドを有するプラス鎖RNAウイルスであり，神経細胞に感染して重篤な脳炎を引き起こす．JEVによって引き起こされた脳炎の致死率は約30％であり，生存者の約50％で後遺症が発生する10）．JEVの標的細胞への接着には，エンベロープタンパク質（Eタンパク質）が関与しているが，細胞側の標的分子に関しては，熱ショックタンパク質Hsp70や多糖グリコサミノグリカン，ラミニンなどの報告もあるが，その実態はわかっていない．また，JEVの標的細胞への侵入方法に関しても細胞によって異なっており，蚊の細胞やブタ腎上皮細胞PK15においてはクラスリン依存性，マウスおよびヒト神経細胞においてはクラスリン非依存性のエンドサイトーシスであること，さらにヒト肝がん細胞Huh7ではSMに富む膜領域である脂質ラフトから侵入するなどと非常に混沌としている．我々はJEVの細胞接着・感染に対する形質膜SMの関与を先にあげたMEFを用いて検討した11）．JEVをMEFの培養上清に添加し，1時間後に除いた後，48時間でのウイルス産生量を細胞内および培養上清中のEタンパク質量によって調べたところ，野生型MEFに比べ，SMS欠損MEFでは著しく減少しており，JEV感染が抑制されていることが示された．また，野生型MEFにおいて細菌SMaseにより前処理し，形質膜SMを減少させておくことでJEV感染が抑制され，逆に，SMS欠損MEFへC₆-SMを添加して形質膜SMを補充した後にJEV感染を行うと，JEV産生量が増加することから，形質膜SMがJEVのMEFへの接着・侵入に関与することが示唆された．そこでウイルスエンベロープを蛍光色素DiLによりラベルした蛍光標識JEVを用いてウイルスの接着を顕微鏡で観察したところ，4°Cにおける形質膜表面へのJEV接着だけでなく，37°C，15分間のJEV処理で，細胞内へ侵入したJEVもSMS欠損MEFでは観察されなかった．また，JEV感染15分後の細胞内Eタンパク質およびJEV RNA量も，SMS欠損MEFにおいて野生型MEFに比べて減少していたことから，JEVの接着・侵入がSMを介していることを示している．興味深いことに，JEVをSM含有リポソームで前処理し，野生型MEFに感染させたところ，48時間後のEタンパク質量が減少していたことからもJEVがSMに接着して細胞へ侵入していることが示された．

ここで用いているSMS欠損MEFは，SMS1およびSMS2両欠損マウスより樹立したものであるため，JEVの接着・感染に関与する形質膜SMの合成に対する貢献度はSMS1とSMS2のどちらが高いのかを明らかにするため，SMS欠損MEFへSMS1またはSMS2を再導入した．SMS欠損MEFへのSMS1の導入はSMS2の導入に比べ，形質膜のSM量がより増加しており，それに一致して，JEVの接着および感染量が回復したことから，SMS1により合成される形質膜SMがJEV感染に関与することが示された．このMEFで明らかとなったSMおよびSMS1のJEV感染への関与が，生体でも影響を受けるかを調べるため，SMS1欠損マウスを用いたJEV感染実験にて検討した．野生型およびSMS1欠損マウスに腹腔内注射にてJEVを投与したところ，野生型マウスは徐々に体重減少や衰弱などの感染の病態がみられたにも関わらず，SMS1欠損マウスでは体重減少などはみられなかった．感染13日後のマウス脳におけるEタンパク質を調べたところ，ウエスタンブロット解析および組織免疫染色ともに野生型マウスでは検出されたが，SMS1欠損マウスでは検出されなかった．また，脳組織を観察したところ，野生型マウスの脳では，髄膜炎やリンパ球浸潤などのJEV感染および脳炎の症状がみられたが，SMS1欠損マウスにおいては，これらの脳炎の病態も観察されなかった．炎症のマーカーである炎症性サイトカインの一つであるインターロイキン6の量も野生型マウスでは著しく増加していたにも関わらず，SMS1欠損マウスでは増加していなかった．以上のことから，SMS1の欠損によりJEV感染が抑制されていることが示唆され，SMS1が合成する形質膜SMのJEV感染への関与が明らかとなった（図2）．しかしながら，SMS欠損細胞でのJEV感染は完全には抑制されてはおらず，残存の少量SMによるものなのか，SM非依存性のJEV接着・侵入の機構が存在するのかは明らかでなく，これからのさらなる研究が期待される．

図2 形質膜SM減少によるJEV感染抑制

4. ウエストナイルウイルス複製と宿主SM

最近，Mertin-Acebesらによって，ウエストナイルウイルス（West Nile virus：WNV）の感染にも生体膜SMとSMSが関与することが報告された12）．WNVはJEVと同じく蚊媒介性のフラビウイルス科フラビウイルス属のプラス鎖RNAウイルスであり，ウエストナイル熱およびウエストナイル脳炎の原因となる．この報告で著者らは，酸性SMase（acid SMase：ASM）欠損マウスを用いている．ASMはニーマン・ピック病A型（Niemann-Pick disease type A：NPA）およびB型（NPB）の原因遺伝子（SMPD1）としても広く知られており，ニーマン・ピック病ではSMPD1遺伝子の変異によるASM活性欠損によってSMの加水分解が抑制されることで，SMが大量に細胞内に蓄積して細胞死が誘導されるが，ASM欠損マウスにおいても脳内のSM量が増加する．WNV感染20日後の野生型マウスの生存率は約70％であるが，ASM欠損マウスでは10％程度とかなり感染が増強されており，感染6日目の脳をはじめとする肝臓，脾臓，腎臓などの臓器でのWNV RNA量が増加していた．また脳組織でのWNVのEタンパク質の免疫染色においても，ASM欠損マウスでは野生型マウスに比べて増加していることが観察された．そこで細胞レベルでのWNV感染へのSMの影響を調べるため，NPA患者より樹立した皮膚線維芽細胞においてWNV感染実験を行った．NPA患者由来細胞はコントロールのヒト初代培養皮膚線維芽細胞に比べSMが蓄積しており，感染24時間後の細胞内WNV量もコントロール細胞に比べ著しく増加していた．また，コントロール細胞へSMを前処理して補充すると，SMの増加とともにWNVの感染も増加することが示された．さらに，アフリカミドリザル腎上皮細胞VeroにSMS阻害剤であるD609, SPK-601およびMS-209で前処理しWNV感染を行ったところ，すべての阻害剤によってWNV感染が低下したことからも，SMSによるSM合成がWNV感染に関与していることが明らかとなった．また，WNV感染したVero細胞での共焦点顕微鏡観察より，小胞体由来のウイルス複製複合体において，ウイルスの複製起点である二本鎖RNA複合体とSMが共局在することから，SMのWNV複製への関与が示唆された．しかしながら，複製複合体におけるSMの役割はわかっておらず，今後の研究が期待される．

5. SM輸送経路を利用したインフルエンザウイルス放出

SMの生合成経路はインフルエンザウイルス（influenza virus：flu）の生活環にも利用されている13）．fluを含む多くのウイルスは標的細胞へ接着・侵入後，自分のDNAまたはRNAを増幅し，宿主のタンパク質合成経路を用いてエンベロープなどのウイルス構成に必要なタンパク質を合成後，子孫ウイルス粒子を再構成し細胞外へ放出され，次の標的細胞へと感染を拡大していく．先にあげたJEVやWNVは細胞内の小胞体内腔へ出芽（budding）することで子孫ウイルス粒子が産生され，細胞内分泌経路を通じて放出される．他方，fluは構造タンパク質が宿主の細胞内輸送経路によって形質膜まで運ばれ細胞表面に露出し，形質膜から出芽することで子孫ウイルス粒子が再構成され放出される．Tafesseらは，SMS1遺伝子SGMS1をジーントラップ法により欠失したヒト一倍体細胞（SGMS1GT）では，コントロール細胞（KBM7）に比べて，fluの子孫ウイルス粒子の産生が抑制されていることを明らかにした13）．SGMS1GT細胞では，SMS2（SGMS2）が残っているにもかかわらず，約80％のSM量が減少しており，SMS1のSM合成における貢献度が非常に高い．興味深いことに，SGMS1GT細胞へのウイルス感染後24時間において，³⁵S-メチオニン／セリンで標識してfluのヘマグルチニン（hemagglutinin：HA）やM1タンパク質の合成量を調べたところ，KBM7細胞と比べて，HAやM1タンパク質の産生量自体は変化しないことから，fluの接着・侵入には差がないことが明らかとなった．また，感染後に³⁵S標識したHAやM1タンパク質の細胞表面への露出がSGMS1GT細胞において著しく低下しており，イヌ腎臓尿細管上皮細胞MDCKへセリンパルミトイル転移酵素阻害剤Myriocin処理を行い，SMを含むスフィンゴ脂質合成を阻害すると，SGMS1GT細胞と同様にfluのタンパク質合成はそのままに，細胞表面への露出が抑えられた．以上のことより，SMS1欠損またはSM合成の阻害によるflu構造タンパク質のゴルジ体から細胞表面への輸送の抑制は，SMS1によって合成されたSMがゴルジ体から形質膜へ輸送されることからも，SM合成–輸送経路をfluが利用していることを示唆している．しかしながら，SMのゴルジ体から形質膜への輸送の分子メカニズムはわかっておらず，細胞表面タンパク質の輸送，たとえば，MHCクラスI糖タンパク質のような一般的な輸送経路を阻害しただけではflu構造タンパク質の形質膜への輸送・露出抑制されないことから，まったく別の輸送経路が存在していることを示している．

6. まとめ

形質膜SMはゴルジ体においてSMSによって合成され，輸送経路によって運ばれる．JEVでは形質膜SMを介したウイルス接着・侵入を，WNVではSMを利用した複製を，また，インフルエンザウイルスはゴルジ体からのSM輸送経路を用いた構造タンパク質の輸送を利用して標的細胞へ感染して病態を示している（図3）．このことから，生体膜SMとSMSは，各々のウイルス感染を予防し，感染拡大を防ぐための標的因子となりうる．しかしながら，SMSは六つの膜貫通ドメインを有する非常に疎水性の高いタンパク質であり，タンパク質精製はできていない．よって，その立体構造も明らかとなっておらず，酵素としての性質も不明な点が多い．またSM自身，単一の分子ではなく数多く存在する異なる炭素鎖の分子種が存在し，その生体膜脂質としての機能の違いはわかっていない．さらに，さまざまな分子種を持つSMの合成を担うSMS1およびSMS2の基質特異性に関してもいまだ不明である．SMSおよびSM生合成は，ウイルス感染だけでなく，細胞増殖から炎症に至るまでさまざまな細胞生理活性を制御している可能性を秘めた非常に興味深い研究対象であり，その機能を明らかにすることによって臨床応用につながることが期待できる．

図3 ウイルスの生活環に関わるSM生合成

本稿で紹介した研究成果は，岡崎俊朗教授（金沢医科大学 血液免疫内科学），竹上勉教授（金沢医科大学 総合医学研究所）のご指導，また，多くの共同研究者の方々のご協力によって得られたものであり，この場を借りて深くお礼申し上げます．

1) Simons, K. & Gerl, M.J. (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 11, 688–699.

2) Taniguchi, M. & Okazaki, T. (2014) Biochim. Biophys. Acta, 1841, 692–703.

3) 北谷和之，浅野智志，橋本真由美，谷口　真，岡崎俊朗（2011）生化学，83, 495–505.

4) Kitatani, K., Taniguchi, M., & Okazaki, T. (2015) Mol. Cells, 38, 482–495.

5) Shakor, A.B., Taniguchi, M., Kitatani, K., Hashimoto, M., Asano, S., Hayashi, A., Nomura, K., Bielawski, J., Bielawska, A., Watanabe, K., Kobayashi, T., Igarashi, Y., Umehara, H., Takeya, H., & Okazaki, T. (2011) J. Biol. Chem., 286, 36053–36062.

6) Asano, S., Kitatani, K., Taniguchi, M., Hashimoto, M., Zama, K., Mitsutake, S., Igarashi, Y., Takeya, H., Kigawa, J., Hayashi, A., Umehara, H., & Okazaki, T. (2012) Mol. Cell. Biol., 32, 3242–3252.

7) Taniguchi, M., Ogiso, H., Takeuchi, T., Kitatani, K., Umehara, H., & Okazaki, T. (2015) Cell Death Dis., 6, e1717.

8) Taniguchi, M., Kitatani, K., Kondo, T., Hashimoto-Nishimura, M., Asano, S., Hayashi, A., Mitsutake, S., Igarashi, Y., Umehara, H., Takeya, H., Kigawa, J., & Okazaki, T. (2012) J. Biol. Chem., 287, 39898–39910.

9) 光武　進（2017）生化学，89, 86–89.

10) Takegami, T., Tasaki, T., Murakami, M., Ishigaki, Y., Taniguchi, M., Nojima, T., & Nukuzuma, S. (2015) in Japanese Encephalitis, pp. 1–17, SMGroup (USA), USA.

11) Taniguchi, M., Tasaki, T., Ninomiya, H., Ueda, Y., Kuremoto, K., Mitsutake, S., Igarashi, Y., Okazaki, T., & Takegami, T. (2016) Sci. Rep., 6, 37829.

12) Martín-Acebes, M.A., Gabandé-Rodríquez, E., García-Cabrero, A.M., Sánchez, M.P., Ledesma, M.D., Sobrino, F., & Saiz, J.C. (2016) J. Lipid Res., 57, 422–432.

13) Tafesse, F.G., Sanyal, S., Shour, J., Guimaraes, C.P., Hermansson, M., Somerharju, P., & Ploegh, H.L. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110, 6406–6411.

谷口 真（たにぐち まこと）

金沢医科大学総合医学研究所生命科学研究領域講師．博士（生命科学）．

略歴 ◇ 1978年岩手県生まれ，福岡県出身．2001年鳥取大学医学部生命科学科卒業，06年同大学大学院医学研究科博士課程修了，同大学医学部博士研究員を経て，12年6月金沢医科大学総合医学研究所助教，14年4月より現職．

研究テーマと抱負 ◇ スフィンゴミエリンおよびセラミドを中心としたスフィンゴ脂質生物学．最近では，動物モデルやイメージングを用いて，生体内でのスフィンゴ脂質の役割を解明することを目的としている．

趣味 ◇ スイーツ探訪，子供と雪遊び，晴れた日はブレイブボード．