みにれびゅう

eIF4A阻害の多様なメカニズム

岩崎 信太郎¹,2)

¹⁾ 理化学研究所RNAシステム生化学研究室 ◇ 〒351–0198 埼玉県和光市広沢2–1生物科学研究棟S206

²⁾ 東京大学大学院新領域創成科学研究科メディカル情報生命専攻

1. はじめに

細胞内ではいわゆる「分子生物学のセントラルドグマ」に従い，ゲノムDNAからRNA, RNAからタンパク質へと遺伝情報が引き渡される．近年の研究からRNAは単なる情報の担い手として働くわけではなく，積極的に制御され，最終的に翻訳されるタンパク質量を絶妙にコントロールしていること，さらにそれらが多種多様な生命現象を引き起こすことが明らかになりつつある．また，翻訳の制御に異常をきたすことによってがんを含む疾患が生じることからもその重要性が示唆されている．それを逆手にとり，異常になった翻訳を薬剤を用いて阻害することにより，がん細胞を標的として攻撃できることが明らかになりつつある1–3）．

2. 翻訳開始因子eIF4A

翻訳は多段階反応を経る非常に複雑な反応である．典型的には「開始」，「伸長」，「終結」の三つのステップに大別されるが，その中でも翻訳開始は全体の反応の律速段階であることが知られており，実際にさまざまなメカニズムで制御を受ける．翻訳の開始はeukaryotic translation initiation factor（eIF）と呼ばれる因子によって行われる．特にcap結合タンパク質であるeIF4E，足場タンパク質であるeIF4G, DEAD-boxタンパク質であるeIF4AからなるeIF4F複合体がmRNAのcap構造を認識することが翻訳開始の第一段階である（図1A）．

図1 eIF4Aの機能

eIF4Aは下記で概観するように多様な種類の分子によって制御を受けることから，その重要性が広く認知されている．eIF4Aを含むDEAD-boxタンパク質は一般にN末端ドメインとC末端ドメイン，またこれらをつなぐリンカーからなる．通常はこれら二つのドメインが離れたopen型の構造をとる．DEAD-boxタンパク質はATP依存的RNA結合タンパク質であると捉えることができ，N末端ドメインとC末端ドメインに挟まれる形でATPが結合し，それに伴ってRNA結合インターフェイスが形成される（これをclosed型と呼ぶ）．同時にDEAD-boxタンパク質はATP加水分解酵素としても働き，ATPをADPに加水分解することによって再びopen型に変化し，RNAから解離する．このATP依存的なRNAへの結合と解離のサイクルが翻訳に重要であることがわかっている（図1B）．

DEAD-boxタンパク質は二本鎖RNAを解くRNAヘリカーゼとしても働く．通常二本鎖RNAはA型ヘリックスを組む．これに対し，DEAD-boxタンパク質上に結合したRNAは折れ曲がった立体配置をとりA型ヘリックスを形成することができない．このことにより，DEAD-boxタンパク質はRNAの二次構造を解きほぐすことができると考えられている．翻訳の開始は一般に43Sリボソーム複合体が5′ UTR（untranslated region，非翻訳領域）上を移動しつつAUG開始コドンを探すスキャニング（scanning）という過程を経る．eIF4AはRNAヘリカーゼ活性により5′ UTR中に生じるRNA二次構造を解きほぐすことによって，スキャニングを促進していると長らく考えられてきた．しかしながら，最新の知見では必ずしもeIF4Aは5′ UTR中の二次構造を解きほぐすだけではないことが示唆されており4, 5），eIF4Aの真の機能を理解するにはより詳細な研究が必要であろう．

3. eIF4Aを介する翻訳阻害

翻訳開始因子は生物にとって必須な因子であるので，遺伝学的な解析が難しい側面がある．しかし，eIF4Aを標的にする小分子化合物が複数単離されており，それらはこの問題を克服することができる非常に有用なツールとして用いられている（表1）．また，それらのいくつかは抗がん作用を持つことも知られており，現在盛んに研究されている．

1）Hippuristanol

HippuristanolはサンゴであるIsis hippurisから単離された天然小分子化合物である6）．この阻害剤はeIF4AのC末端ドメインに結合し，N末端ドメインとの分子内相互作用を阻害することでclosed型構造の形成を抑制していると考えられている7）．これによりeIF4AはRNAと結合することができない．以上のような性質から，Hippuristanolは単純にeIF4Aの活性を不活化すると考えられており，広く翻訳研究に用いられている5, 6）．

2）Pateamine A

Pateamine Aも同様に海洋生物であるミカーレカイメン属（Mycale sp.）の海綿から単離された天然小分子化合物である8, 9）．しかしながら，Pateamine Aの効果はHippuristanolと対照的である．Pateamine AはeIF4Aのリンカー配列に結合しつつclosed型の構造を促し，その結果eIF4AとRNAの結合を安定化させる10）．これにより，eIF4AはmRNAに非特異的に結合しトラップされてしまう．最終的に翻訳に参加することのできるeIF4Aの量が減少し，翻訳が阻害されると考えられている11）．

以上のような小分子はもとより，eIF4Aは自身に結合するタンパク質からも制御を受ける．eIF4Aは内在のタンパク質に加え，外来病原体由来のタンパク質の標的にもなっている（表1）．

3）PDCD4（programmed cell death 4）

PDCD4は腫瘍抑制因子として働くタンパク質であり，eIF4Aへの結合を通じて翻訳を阻害する．通常の細胞ではPDCD4がリン酸化やプロテオソーム系による分解を介して不活化され，翻訳は阻害されずにすみ，細胞が増殖する．PDCD4はMA3と呼ばれるドメインを二つ持つがこれらが協調して，2分子のeIF4Aと結合する．PDCD4に結合したeIF4Aはclosed型の構造をとることができず活性が阻害される12）．また，eIF4A上のPDCD4への結合領域はeIF4Gへの結合領域とオーバーラップしているので，競合阻害が生じさらに翻訳が阻害されると考えられる13）．

4）RISC（RNA-induced silencing complex）

小分子RNAの一種であるmicro RNA（miRNA）はArgonauteタンパク質に直接取り込まれ，RISCと呼ばれる複合体を形成する．RISCはmiRNAをガイドに，その配列と相補的な配列を持つmRNAからの翻訳を阻害することが知られている．そのメカニズムの詳細については未知の部分が多いが，eIF4Aを標的mRNAから乖離させ，翻訳を阻害することが報告されている14, 15）．

5）BLF1（Burkholderia lethal factor 1）

類鼻疽菌Burkholderia pseudomalleiは類鼻疽（Melioidosis）を引き起こす病原菌である．Burkholderiaが持つ毒素として単離されたのがBLF1と呼ばれるタンパク質である．このタンパク質はeIF4A C末端ドメインのATP結合サイト上，Q339残基の脱アミドを引き起こす．これにより二本鎖RNAを解消する活性が阻害され，翻訳阻害を誘導する16）．

6）FMDV（foot-and-mouth disease virus）3C protease

一般的にウイルスは宿主に感染すると，自身の複製に都合のよいように宿主のシステムをハイジャックする．その戦略の一つとして宿主のmRNAの翻訳のみを阻害し，ウイルスタンパク質の合成だけを行わせることがあげられる．口蹄疫ウイルス（FMDV）は3C proteaseと呼ばれる酵素を持っており，eIF4Aタンパク質をE143とV144残基の間で切断することにより17），内在の翻訳系を阻害する．ウイルス自身のタンパク質は，internal ribosome entry site（IRES）と呼ばれる配列を利用した翻訳開始因子の必要のないシステムにより効率よく合成される．

また小分子やタンパク質のみならずRNA分子としてeIF4Aの阻害を行うものが知られている（表1）．

7）人工RNAアプタマー

SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法を用いて人工的に単離されたRNAアプタマー18）は，詳細なメカニズムはよくわかっていないが，通常のeIF4A-RNAの結合様式とは独立して，eIF4Aに結合し，eIF4Aを不活性な構造に変化させると考えられている．最終的にATPaseなどの生化学的活性を押さえ込み翻訳を阻害することが示唆されている．

8）BC1（brain cytoplasmic 1）RNA

eIF4Aは内在のRNA，特にnon-coding RNAによっても制御を受ける．BC1は神経細胞の特に樹状突起に強く発現する150塩基長程度のnon-coding RNAであり，eIF4Aの二本鎖RNAを解消する活性を阻害しつつ翻訳を阻害することが示されている19）．神経細胞の樹状突起は局所翻訳が起こる場としてよく研究されており，学習や長期記憶に重要であることが知られている．BC1によるeIF4Aを介した翻訳制御がその一端を担っている可能性がある．

4. RocAによるmRNA選択的翻訳抑制のメカニズム

以上のように，eIF4Aはさまざまな種類の分子によって標的にされ，多様な生物学的現象を制御することが明らかになりつつある．我々の研究グループはさらにその一端を明らかにすべく，eIF4Aを標的とする翻訳阻害剤であるrocaglamide A（RocA）の分子機構について研究してきた5）．RocAはもともとAglaiaと呼ばれる東南アジア原産の植物から単離された天然化合物である．Aglaia自身はこの化合物を天然の殺虫剤として使っていると考えられている．また，Aglaiaは漢方薬として用いられている他，観葉植物としても広く流通している．

RocAは抗がん作用を持つ化合物のスクリーニングで同定されてきた1, 3）．特にがん細胞を特異的に死滅させ，通常の細胞には影響が少ないという，非常に有用な活性が報告されたことにより，現在広く注目を集めている．

RocAを抗がん剤として利用あるいはさらに改良するためには，その分子メカニズムの理解が必須である．しかしながら，RocAがどのようなメカニズムによって翻訳を抑制するかについては不明であった．そこで我々はRocAによる翻訳抑制のメカニズムを理解するため，網羅的解析と生化学的解析を組み合わせて研究を行った5）．

その結果，RocAは本来配列非特異的な翻訳開始因子であるeIF4Aを配列特異的な翻訳阻害因子に変化させてしまうという，非常にユニークな機構を持っていることが明らかになった（図2）．RocAはeIF4Aに結合すると，AやGが連続したポリプリン配列を持つRNAとの結合を特異的に促進する．また，eIF4A自身は通常ATP加水分解とともにRNAから解離するが，RocAが作用するとeIF4AはATP加水分解後であってもポリプリンRNAから乖離せずに結合し続ける．たとえば通常はeIF4AとRNAの結合の半減期は2分以内であるのに対して，RocAを作用させた場合は30分程度と非常に安定化する．

図2 RocAによるmRNA選択的な翻訳抑制機構

さらにポリプリンRNA上に安定的に結合したeIF4Aは翻訳の立体障壁となる．eIF4A/RocAが5′ UTR中のポリプリン配列に結合し，安定して複合体が形成されてしまうと，5′ UTR上をスキャニングするリボソーム小サブユニット動きを阻害してしまう．これによってポリプリンを5′ UTR中に持つmRNAを選択的に翻訳抑制する．その一方，正常なeIF4AはATPの加水分解とともに結合と解離を繰り返すので，そのような効果は引き起こさない．

5. おわりに

以上のように我々の行った研究によってRocAが持つ非常にユニークな活性が明らかになった．RocAは基本骨格が共通であるrocaglateという分子群に大別されるが，同じrocaglateである翻訳阻害剤silvestrolに関しても同様のメカニズムで翻訳抑制を行っていると考えられる．ではrocaglateはどうしてeIF4Aに新規RNA特異性を付与することができるのであろうか？ 一般的にDEAD-boxタンパク質はRNAのリン酸−リボースバックボーンのみを認識し，塩基には触れないことがこれまでの結晶構造解析から示唆されている．このことを踏まえると，1）rocaglateによってeIF4A自体の構造が変化し，塩基配列を認識する構造が新たに生み出される可能性，あるいは2）rocaglate自体がRNAの塩基に直接結合し，塩基特異性が生じる可能性の二つが考えられる．これまでに報告されているin silico modelingではeIF4A上のRNA結合インターフェイス上にRocAが結合することが予想されていることから20），筆者は後者の可能性が高いのではないかと推察する．いずれの仮説が正しいか，RocAと標的ポリプリン配列の両者を含んだeIF4Aの結晶構造解析が待たれる．

本研究ではHEK293T細胞を主に使用したが，ここで明らかになったメカニズムはがん細胞でも同様であると考えるのが，最も単純な考え方である．ではなぜ選択翻訳の抑制によってがん細胞を標的にすることができるのだろうか．この点に関しても明確なメカニズムは明らかになっておらず，さらなる詳細な解析が期待される．

本研究はUC Berkeley, Nick Ingolia准教授，Stephen Floor（現UCSF准教授）博士研究員のご協力のもと行われました．深く御礼を申し上げます．また，理化学研究所RNAシステム生化学研究室のメンバーの皆さんには本稿に対するコメントをはじめ，日ごろのサポートに深く感謝いたします．本稿を執筆するにあたりHFSP, 日本学術振興会，理化学研究所，武田科学振興財団の助成を受けました．

1) Santagata, S., Mendillo, M.L., Tang, Y.C., Subramanian, A., Perley, C.C., Roche, S.P., Wong, B., Narayan, R., Kwon, H., Koeva, M., Amon, A., Golub, T.R., Porco, J.A.J. Jr., Whitesell, L., & Lindquist, S. (2013) Science, 341, 1238303.

2) Wolfe, A.L., Singh, K., Zhong, Y., Drewe, P., Rajasekhar, V.K., Sanghvi, V.R., Mavrakis, K.J., Jiang, M., Roderick, J.E., Van der Meulen, J., Schatz, J.H., Rodrigo, C.M., Zhao, C., Rondou, P., de Stanchina, E., Teruya-Feldstein, J., Kelliher, M.A., Speleman, F., Porco, J.A. Jr., Pelletier, J., Rätsch, G., & Wendel, H.G. (2014) Nature, 513, 65–70.

3) Manier, S., Huynh, D., Shen, Y.J., Zhou, J., Yusufzai, T., Salem, K.Z., Ebright, R.Y., Shi, J., Park, J., Glavey, S.V., Devine, W.G., Liu, C.J., Leleu, X., Quesnel, B., Roche-Lestienne, C., Snyder, J.K., Brown, L.E., Gray, N., Bradner, J., Whitesell, L., Porco, J.A. Jr., & Ghobrial, I.M. (2017) Sci. Transl. Med., 9.

4) Sen, N.D., Zhou, F., Ingolia, N.T., & Hinnebusch, A.G. (2015) Genome Res., 25, 1196–1205.

5) Iwasaki, S., Floor, S.N., & Ingolia, N.T. (2016) Nature, 534, 558–561.

6) Bordeleau, M.E., Mori, A., Oberer, M., Lindqvist, L., Chard, L.S., Higa, T., Belsham, G.J., Wagner, G., Tanaka, J., & Pelletier, J. (2006) Nat. Chem. Biol., 2, 213–220.

7) Lindqvist, L., Oberer, M., Reibarkh, M., Cencic, R., Bordeleau, M.E., Vogt, E., Marintchev, A., Tanaka, J., Fagotto, F., Altmann, M., Wagner, G., & Pelletier, J. (2008) PLoS One, 3, e1583.

8) Bordeleau, M.E., Matthews, J., Wojnar, J.M., Lindqvist, L., Novac, O., Jankowsky, E., Sonenberg, N., Northcote, P., Teesdale-Spittle, P., & Pelletier, J. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 10460–10465.

9) Low, W.K., Dang, Y., Schneider-Poetsch, T., Shi, Z., Choi, N.S., Merrick, W.C., Romo, D., & Liu, J.O. (2005) Mol. Cell, 20, 709–722.

10) Low, W.K., Dang, Y., Bhat, S., Romo, D., & Liu, J.O. (2007) Chem. Biol., 14, 715–727.

11) Bordeleau, M.E., Cencic, R., Lindqvist, L., Oberer, M., Northcote, P., Wagner, G., & Pelletier, J. (2006) Chem. Biol., 13, 1287–1295.

12) Chang, J.H., Cho, Y.H., Sohn, S.Y., Choi, J.M., Kim, A., Kim, Y.C., Jang, S.K., & Cho, Y. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 3148–3153.

13) Suzuki, C., Garces, R.G., Edmonds, K.A., Hiller, S., Hyberts, S.G., Marintchev, A., & Wagner, G. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 3274–3279.

14) Fukaya, T., Iwakawa, H.O., & Tomari, Y. (2014) Mol. Cell, 56, 67–78.

15) Fukao, A., Mishima, Y., Takizawa, N., Oka, S., Imataka, H., Pelletier, J., Sonenberg, N., Thoma, C., & Fujiwara, T. (2014) Mol. Cell, 56, 79–89.

16) Cruz-Migoni, A., Hautbergue, G.M., Artymiuk, P.J., Baker, P.J., Bokori-Brown, M., Chang, C.T., Dickman, M.J., Essex-Lopresti, A., Harding, S.V., Mahadi, N.M., Marshall, L.E., Mobbs, G.W., Mohamed, R., Nathan, S., Ngugi, S.A., Ong, C., Ooi, W.F., Partridge, L.J., Phillips, H.L., Raih, M.F., Ruzheinikov, S., Sarkar-Tyson, M., Sedelnikova, S.E., Smither, S.J., Tan, P., Titball, R.W., Wilson, S.A., & Rice, D.W. (2011) Science, 334, 821–824.

17) Li, W., Ross-Smith, N., Proud, C.G., & Belsham, G.J. (2001) FEBS Lett., 507, 1–5.

18) Oguro, A., Ohtsu, T., Svitkin, Y.V., Sonenberg, N., & Nakamura, Y. (2003) RNA, 9, 394–407.

19) Lin, D., Pestova, T.V., Hellen, C.U., & Tiedge, H. (2008) Mol. Cell. Biol., 28, 3008–3019.

20) Sadlish, H., Galicia-Vazquez, G., Paris, C.G., Aust, T., Bhullar, B., Chang, L., Helliwell, S.B., Hoepfner, D., Knapp, B., Riedl, R., Roggo, S., Schuierer, S., Studer, C., Porco, J.A.J. Jr., Pelletier, J., & Movva, N.R. (2013) ACS Chem. Biol., 8, 1519–1527.

岩崎 信太郎（いわさき しんたろう）

理化学研究所RNAシステム生化学研究室主任研究員．東京大学大学院新領域創成科学研究科メディカル情報生命専攻客員准教授．博士（生命科学）．

略歴 ◇ 2006年東京大学教養学部卒業．11年同大学院新領域創成科学研究科博士課程修了，同年東京大学分子細胞生物学研究所助教，13年より米国Carnegie Institution for Scienceを経て，米国California大学Berkeley校ポスドクフェロー．16年より理化学研究所RNAシステム生化学研究室准主任研究員，17年改組により主任研究員．また17年より東京大学新領域創成科学研究科メディカル情報生命専攻客員准教授．

研究テーマと抱負 ◇ RNAのかかわる現象を網羅的かつ生化学的な手法により理解する．

ウェブサイト ◇ http://www.riken.jp/research/labs/chief/rna_sys_biochem/

趣味 ◇ コンソールゲーム．