みにれびゅう

活性硫黄分子産生酵素に対する新規阻害剤の開発

越膳 ほなみ・花岡 健二郎

東京大学大学院薬学系研究科薬品代謝化学教室 ◇ 〒113–0033　東京都文京区本郷7–3–1

1. はじめに

硫化水素（H₂S）は一酸化炭素（CO）や一酸化窒素（NO）に次ぐ，第三のガス状シグナル伝達物質として注目され，血管拡張や炎症などに関与する含硫黄小分子として注目されてきた1）．さらに近年，酸化数0の硫黄原子であるスルファン硫黄（sulfane sulfur：S⁰）を含む小分子の生理機能に注目が集まっている（図1A）．S⁰は他の硫黄原子に可逆的に結合しポリスルフィド（polysulfide：–S–Sn–S–）やハイドロパースルフィド（persulfide：–S–SH）といった形で存在し，活性酸素と反応することで抗酸化作用を示すと報告されている2）．一方，H₂SやS⁰などの活性硫黄分子の産生酵素として，3-メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase：3MST）およびシスタチオニンγリアーゼ（cystathionine γ-lyase：CSE），シスタチオニンβ合成酵素（cystathionine β-synthase：CBS），システイニルtRNA合成酵素（cysteinyl-tRNA synthetases：CARSs）の四つが報告されている1, 3–5）．いずれも，アミノ酸を基質として働く酵素であり，3MSTはチオレドキシン（thioredoxin）やジヒドロリポ酸（dihydrolipoic acid）などのジチオールの存在下で3-メルカプトピルビン酸（3-mercaptopyruvate：3MP）を基質としてH₂SやH₂S₂，H₂S₃を産生すると報告されている4）（図1B）．一方でCSEは主にシステインを基質として，CBSはシステインとホモシステインの縮合反応でシスタチオニンとともにH₂Sを産生する．また，S⁰の産生の際には，CSEとCBSはシスチンを基質とし，CARSsはシステインを基質とすると報告されている5）．

図1 生体内の活性硫黄分子種とそれらの産生酵素

2. 活性硫黄分子産生酵素の既存の阻害剤

酵素の機能を解明するためのツールの一つとして，その酵素に対する選択的阻害剤がある．活性硫黄分子産生酵素に対しても，これまでに使用されてきた阻害剤が存在するため，以下にそれぞれの酵素に対する既存の阻害剤について紹介する．まず，CSEの阻害剤としてはD,L-プロパルギルグリシン（D,L-propargylglycine：PAG）とβ-シアノ-L-アラニン（β-cyano-L-alanine：BCA）が，CBSの阻害剤としてはアミノオキシ酢酸（aminooxyacetic acid：AOAA）が主に汎用されている（図1C）6）．しかしながら，これらの阻害剤は，選択性や生細胞における活性に問題を抱えており，新規阻害剤の開発が求められている．近年，CBS, CSEに対する新規阻害剤の開発が報告されているため，以下にいくつかを紹介する．2016年にはシステインと構造がよく似たD-ペニシラミン（D-penicillamine：D-pen）がCBSよりもCSEに対して強い阻害作用を示し（IC₅₀はそれぞれ8.5 mM, 0.27 mM），この構造がCSEに対する新規阻害剤の骨格として有用であると報告されている（図1C）7）．また，同じく2016年にフラグメントの組合わせに基づいた新規CSE阻害剤の開発に関する論文が発表され，既存の阻害剤であるPAGの，CSEとの結合形成部位であるプロパルギル基と，CSEの基質であるシステインの誘導体を組み合わせた化合物が，選択性が高く，かつPAGよりも強い阻害作用を示すことを報告している（図1C）8）．また，CBSの新規阻害剤の開発において，2013年にはH₂Sを検出する蛍光プローブ（AzMC）の開発（図2A）と，AzMCを利用したCBS阻害剤の開発が報告されている9）．一方，CARSsの活性硫黄分子の産生機能は近年報告されたばかりであり，その阻害剤はいまだ開発されていない10）．

図2 H₂Sを検出する蛍光プローブ

3MSTに対する非選択的阻害剤としてピルビン酸，メナジオン，3-メルカプトプロピオン酸，3-クロロピルビン酸が報告されていたが（図1C）10），選択的な阻害剤は報告されていなかった．そこで近年，我々は3MSTに対する阻害剤の開発に取り組み，世界初の選択的阻害剤の開発に成功した11）．本稿においては，その研究内容を中心に紹介する．

3. H₂S検出方法

1）従来のH₂S検出方法と蛍光プローブの開発

これまでに，H₂Sの検出方法として，メチレンブルー法やガスクロマトグラフィー法，HS⁻選択的電極等が報告されていたが，依然としてこれらの方法では生体内のH₂Sをリアルタイムに検出することは難しかった．そこで我々は，3MSTに対する阻害剤開発に先立ち，生体サンプル内でH₂Sをリアルタイムに検出できる蛍光プローブの開発を行った12）．H₂Sを検出する蛍光プローブを開発するにあたり最も考慮すべきは，H₂Sに対して高い感度と選択性を示すことであった．細胞内にはチオール基を有する生体分子としてグルタチオン（GSH，約1～10 mM）やシステイン（約100 µM），タンパク質などが存在し，開発する蛍光プローブはこれらに対し高い選択性を示す必要があった．また，細胞内のH₂S濃度は明確には決定されていなかったが，10 µM～1 mMのH₂Sの添加により生理作用が引き起こされる報告があるため，少なくとも10 µMのH₂Sを検出できる蛍光プローブの開発を目指した．

2）H₂S検出蛍光プローブHSip-1の開発

H₂S検出蛍光プローブとして，一般的によく使われている蛍光色素であるフルオレセインと，環状ポリアミンにキレートされたCu2＋を有する分子を分子設計した（図2B）．これは，Cu2＋が近傍に存在する蛍光団の蛍光を消光することと，環状ポリアミン構造がCu2＋とキレート効果により安定な錯体構造を形成すること，さらには，Cu2＋はH₂Sと結合しCuSを生成することを利用した設計である．つまり，H₂Sとの反応前のフルオレセインの蛍光はCu2＋により消光されているが，H₂SとCu2＋が結合することでCu2＋が環状ポリアミン構造から外れ，強い蛍光強度を示すと期待した．

まず，最適な環状ポリアミン構造の検討を行った．異なる環状ポリアミン構造（トリアザシクロノナン，サイクレン，サイクラム，トリメチルサイクレン）を持つ四つのフルオレセイン誘導体を合成し，評価を行った（図2B）．はじめに，各化合物の吸収・蛍光特性を測定した結果，いずれの化合物も490 nm付近に吸収極大波長を，515 nm付近に蛍光極大波長を示した．また期待どおりに，Cu2＋をキレートさせたものでは，Cu2＋による強い消光のために蛍光が低く抑えられており，ほとんど蛍光を示さなかった．次に，H₂Sに対する選択性を評価するために，10 µM Na₂S（H₂Sドナー）と10 mM GSHに対する応答性を評価したところ，サイクレンを用いた化合物であるHSip-1は10 mM GSHにはほとんど蛍光の上昇を示さなかったが，一方で，10 µM Na₂Sに対しては迅速な蛍光強度の上昇を示した．合成・検討した他の三つの分子は，GSHに対する選択性が十分にない，あるいはH₂Sに対する応答が迅速でなかった．そのため，選択的なH₂S検出蛍光プローブとしてHSip-1が最適な構造であると考えた（図2C, D）．さらにHSip-1のH₂Sに対する選択性を精査したところ，還元型グルタチオン，システイン，ホモシステイン，各種無機含硫化合物［2-メルカプトエタノール，ジチオトレイトール（DTT），NaSCN, Na₂SO₃，Na₂S₂O₃］，活性酸素種，活性窒素種の添加によっても，蛍光強度の上昇はみられなかった（図2E）ため，H₂Sに対する高い選択性を示す蛍光プローブの開発に成功した．

4. 3MST阻害剤の開発

1）HSip-1を用いた大規模ハイスループットスクリーニング

次に，開発したH₂S検出蛍光プローブであるHSip-1を用いて，活性硫黄分子産生酵素である3MSTの阻害剤の開発を行った．具体的には，HSip-1が高い感度および高い選択性を示すことに着目し，蛍光プローブを用いた大規模ハイスループットスクリーニング（HTS）を行った．はじめに，マウス3MSTの大量発現・精製方法の確立を行い，基質である3MPとDTTから産生されるH₂Sをin vitroにおいて検出する系の構築を行った（図3A）．その系を用いて，174,118化合物を用いた大規模HTSを行った結果，10 µMの化合物濃度においてHSip-1の蛍光強度上昇を80％以上阻害する四つの化合物（化合物1～3, 5）を得ることに成功した（図3B）．このうち，化合物1～3は共通してピリミドン構造を有しており，この構造が3MSTの阻害に重要であると考えられた．

図3 新たな3MST選択的阻害剤

2）3MSTに対する選択性に関する評価

ヒット化合物が3MSTに対して選択性を示すか調べるために，我々は二つの実験を行った．まず，他のH₂S産生酵素であるCSEおよびCBSに対して四つのヒット化合物の阻害活性をガスクロマトグラフィー法により測定し，これらの化合物が3MSTに対して選択性を示すか調べた．その結果，化合物3はCSEおよびCBSに対してはほとんど阻害活性を示さないことがわかった．

次に，3MSTと57.6％という高い構造類似性を有する酵素（ロダネーゼ）に対する阻害活性を測定した．ロダネーゼはシアン化物イオンへの硫黄転移に関与し，シアン化物イオンの解毒に関係している酵素である．シアン化物イオンとチオ硫酸塩から産生されるチオシアン酸塩に対して，その定量法であるSörbo法を用いて阻害活性を評価したところ（図3C），100 μMの化合物濃度において，化合物1が18.2±3.6％，化合物2が10.9±5.5％，化合物3が1.7±6.7％，化合物5が9.7±4.5％の阻害率であり，化合物1が若干の阻害活性を示すものの，四つのヒット化合物はいずれもほとんど阻害活性を示さなかった．上記二つの選択性に関する実験の結果，化合物3が3MSTに対する優れた選択的阻害剤であることがわかった．

3）ヒット化合物の阻害形式

ヒット化合物の3MSTに対する阻害形式を調べるためにX線結晶構造解析を行い，化合物1および3と3MSTの共結晶を得た（図3D）．その結果，活性部位にあるCys²⁴⁸残基がジスルフィド化している（Cys–SH→Cys–S–SH）ことが明らかになり，さらにこのCys²⁴⁸残基と，化合物1および3のピリミドン構造が相互作用を形成していると考えられた．そこで，開発した阻害剤は，248番のCys残基がジスルフィド化した3MSTとのみ相互作用を形成するのか検討するため等温滴定型熱量測定（ITC）を行った．ジスルフィド化した3MSTとジスルフィド化していない3MSTを用いて，化合物1および3との相互作用をそれぞれ測定したところ，ジスルフィド化した3MSTを用いたときのみ相互作用を示すことがわかった．

3MSTのH₂Sの産生反応においては，まず3MSTの活性部位のシステイン残基が，基質の3MPによりジスルフィド化されることから始まる．その後，他のチオール分子により硫黄原子が引き抜かれることでハイドロパースルフィドが形成し，H₂Sが産生される．今回開発した阻害剤は，H₂S産生機構の第一段階により生じる中間体であるジスルフィド化した3MSTに対して結合を形成し，阻害作用を示していると考えられる（図1B）．

5. おわりに

近年硫黄原子を含む生体内小分子が注目されている中，我々はH₂Sを高い感度で選択的に検出可能な蛍光プローブを開発し，それを用いてH₂S産生酵素の一つである3MSTに対して選択的な阻害剤の開発に成功した．今回開発した3MSTに対する選択的阻害剤が，活性硫黄分子産生酵素である3MSTの生理機能の解明に貢献することを期待している．また，今回の阻害剤開発において，H₂Sの検出方法としてH₂S検出蛍光プローブを用いたが，さらに近年，我々はS⁰を可逆的に検出可能な蛍光プローブ（SSip-1）の開発にも成功している13）．HSip-1やSSip-1が，今後の活性硫黄分子の阻害剤開発のためのツールとして利用され，本分野がさらに進展することを期待する．

本研究は，東京大学大学院薬学系研究科薬品代謝化学教室で行われたものであり，本研究に関わる多くの大学院生，スタッフならびに外部の共同研究者に謝意を表します．特にX線結晶解析においては，東京大学大学院薬学系研究科・清水敏明教授，藤間祥子助教，諏訪内悠介博士に，阻害剤スクリーニングにおいては，東京大学創薬機構・長野哲雄客員教授，岡部隆義特任教授，小島宏建特任教授に，計算化学においては，東京大学大学院薬学系研究科・内山真伸教授，王超助教に，3MSTのプラスミドの提供については，国立精神・神経医療研究センター・木村英雄博士に深く感謝いたします．

1) Paul, B.D. & Snyder, S.H. (2012) H₂S signalling through protein sulfhydration and beyond. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 13, 499–507.

2) Mishanina, T.V., Libiad, M., & Banerjee, R. (2015) Biogenesis of reactive sulfur species for signaling by hydrogen sulfide oxidation pathways. Nat. Chem. Biol., 11, 457–464.

3) Ida, T., Sawa, T., Ihara, H., Tsuchiya, Y., Watanabe, Y., Kumagai, Y., Suematsu, M., Motohashi, H., Fujii, S., Matsunaga, T., et al. (2014) Reactive cysteine persufides and S-polythiolation regulate oxidative stress and redox signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111, 7606–7611.

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5) Akaike, T., Ida, T., Wei, F.Y., Nishida, M., Kumagai, Y., Alam, M.M., Ihara, H., Sawa, T., Matsunaga, T., Kasamatsu, S., et al. (2017) Cysteinyl-tRNA synthetase governs cysteine polysulfidation and mitochondrial bioenergetics. Nat. Commun., 8, 1177.

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12) Sasakura, K., Hanaoka, K., Sgubyta, N., Mikami, Y., Kimura, Y., Komatsu, T., Ueno, T., Terai, T., Kimura, H., & Nagano, T. (2011) Development of a highly selective fluorescence probe for hydrogen sulfide. J. Am. Chem. Soc., 133, 18003–18005.

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越膳 ほなみ（えちぜん ほなみ）

東京大学大学院薬学系研究科薬科学専攻修士課程2年．

略歴 ◇ 2017年東京大学薬学部薬科学科卒業．同年4月より東京大学大学院修士課程薬学系研究科薬科学専攻に在籍．

研究テーマと抱負 ◇ 活性イオウ分子に関する研究テーマに取り組んでいる．

花岡 健二郎（はなおか けんじろう）

東京大学大学院薬学系研究科准教授．博士（薬学）．

略歴 ◇ 2000年東京大学薬学部薬学科卒業．05年同大学院修了［博士（薬学）］．同年より米国テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターにて博士研究員．07年東京大学大学院薬学系研究科・助教，10年より同講師，11年より同准教授（現職）．

研究テーマと抱負 ◇ 生体内可視化プローブ及び生体制御ケミカルツールの開発とその応用による生命現象の解明に従事している．

ウェブサイト ◇ http://www.f.u-tokyo.ac.jp/~taisha/