みにれびゅう

心臓のリズムを刻むイオンチャネル複合体の“複雑な”制御

中條 浩一

自治医科大学医学部生理学講座統合生理学部門 ◇ 〒329–0498栃木県下野市薬師寺3311–1

1. はじめに

心臓は生まれてから死ぬまで一時も休むことなくリズムを刻み続ける．その活動は体内の隅々まで酸素や栄養素を送り，また各組織から二酸化炭素や老廃物を回収するために不可欠である．この心臓のリズムは，神経細胞などと同じく活動電位と呼ばれる電気信号によって生み出される．細胞膜上にはイオンチャネルと呼ばれる膜タンパク質が存在し，それぞれ特定の種類のイオンを細胞内外に出し入れすることで活動電位を生み出す．心室筋においては，まずナトリウムチャネルが開いてナトリウムイオン（Na＋）を細胞内に流入することで細胞内電位がマイナスから大きくプラス方向に変化する（生理学分野では“興奮”あるいは“脱分極”と呼ばれる）．続いてカルシウムチャネルが開いてカルシウムイオン（Ca2＋）を流入させ，心室筋を収縮させる．最後にカリウムチャネルによってカリウムイオン（K＋）が細胞内から流出することで細胞内電位はマイナスに戻り（再分極），心室筋は弛緩する．心電図波形においてはQ波の開始からT波の終了までをQT間隔と呼び，心室筋が脱分極している期間に相当する．したがってたとえばカリウムチャネルの機能が失われると，再分極しにくくなるために脱分極している時間が長くなり，QT間隔が延長する（QT延長症候群）などの不整脈を引き起こす可能性がある．

KCNQ1チャネルは40種類存在する電位依存性カリウムチャネル（Kv）ファミリーの一つである．Kvファミリーに特徴的な6回膜貫通型のタンパク質であり，四つの分子（αサブユニット）で一つのイオンチャネルを構成する，四量体の分子複合体である（図1A, B）．それぞれのαサブユニットは電位センサードメイン（voltage sensing domain：VSD）とポアドメイン（pore domain：PD）に分かれる．四量体を構成したとき，PDは4分子が組み合わさることで一つのイオン透過路を構成するが，四つのVSDは独立に存在し，それぞれが電位を感じて構造変化すると考えられている（図1B）．細胞が脱分極すると，VSD中のS4と呼ばれる4番目の膜貫通ヘリックスが上（細胞外）に向かってスライドする．四つすべてのS4が上に上がると，それが引き金となってPDが開き，イオンが流れる．

図1 KCNQ1とKCNE1の構造と電流

KCNQ1チャネルの基本的な構造，性質は他のKvチャネルと共通であるが，一つ非常にユニークな特徴がある．それはKCNEと呼ばれる1回膜貫通型のタンパク質により，ゲーティング（開閉）の性質が大きく変化するということである．KCNE1は今からおよそ30年前，京都大学の内匠らによって初めてクローニングされた1）．内匠らは，イオンチャネル研究でよく用いられるアフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞に，このわずか130アミノ酸長の遺伝子を発現させることでゲーティングが非常に遅い電位依存性カリウム電流を生じることを発見した．当初はこれ自体が新規のイオンチャネルである可能性も議論されたが，発見から8年後，QT延長症候群の原因遺伝子として同定されていたKCNQ1チャネルに対する補助サブユニットであることが判明した2, 3）．KCNQ1とKCNE1をともに発現させると，心臓でみられる「遅いカリウム電流」に相当する電流が測定される（図1C下）．ちなみに内匠らが最初に発見した電流は，外部から導入されたKCNE1がアフリカツメガエル卵母細胞の内在性KCNQ1チャネルの電流を増大させたことによって生じた電流であったと考えられている．以後KCNE1～5まで，合計5種類のKCNEが見つかっており，すべてKCNQ1の機能を大幅に変化させることが知られている4）．そのなかでもKCNQ1–KCNE1複合体によって生み出される「遅いカリウム電流」は，QT延長症候群との関連からとりわけ注目を集めてきた．特にどのようにしてKCNE1がKCNQ1のゲーティングを遅くするのか，すなわち開きにくく閉じにくいチャネルに変化させるのかについて，その分子メカニズムを明らかにするために多くのグループが奮闘してきた．またKCNQ1–KCNE複合体の分子構成，すなわちストイキオメトリーについても，KCNE1の発見から長きにわたって議論が続いている．本稿では，これらについての最近の知見を中心にご紹介したい．

2. KCNEによるイオンチャネル電位センサードメインの制御

なぜKCNE1が共発現するとKCNQ1チャネルは開きにくくなるのであろうか．その非常にゆっくりとしたゲーティングから，我々は電位センサーとして働くS4の脱分極時の構造変化が，KCNE1によって遅くなるという仮説を立てた．そこでS4の上部に点変異としてシステインを導入し，その構造変化の速度をMTSETなどのシステイン修飾剤の化学修飾速度で間接的に見積もり，KCNE1の存在によりS4がなかなか上に上がってこないことを示した5）．

一般的に，電位依存性カリウムチャネルは少なくとも三つの状態をとると考えられている（チャネルの四量体構造を考慮すると実際はもっと複雑であるが，ここではシンプルに三つの状態で考える）．一つ目はS4が完全に下がった状態で，静止状態（resting state）と呼ばれる．二つ目はS4が上がっているがチャネルのゲートはまだ閉じている中間状態（intermediate state），そしてS4が完全に上がりゲートも開いた活性化状態（activated state）である（図2A）．細胞内が静止状態，すなわち負の電位（おおむね−60 mV以下）を持つとき，大半のVSDは静止状態にある．細胞内が脱分極する（細胞内電位が＋の方向に向かう）と，VSDは中間状態を経て活性化状態に入る．前述したとおり，四つのVSDすべてが活性化状態に入るとイオンチャネルは開くと考えられている．

図2 voltage-clamp fluorometry（VCF）による電位センサーの構造変化と電流の同時測定

KCNE1の存在によりS4がなかなか上に上がってこないことはわかったが，「静止状態から中間状態」または「中間状態から活性化状態」のどちらのステップが阻害されるのであろうか．この問いに答えるためには，S4の構造変化をより直接的に調べることが必要である．そこでS4の上部に導入したシステイン残基に今度は蛍光分子（Alexa-488）を導入し，膜電位をコントロールした状況で，電流と蛍光強度変化を同時に測定するvoltage-clamp fluorometry（VCF）という方法を導入した6, 7）．KCNE1が入ったときに，蛍光強度変化と電流がどちらも遅くなれば，静止状態から中間状態のステップが，蛍光強度変化は変わらず電流だけが遅くなれば「中間状態から活性化状態」のステップが遅くなっていると結論できる．図2Bにあるように，結果は後者であった．つまりKCNE1が存在しても電位センサーは中間状態まで問題なく上がることができるのであるが，チャネルが開く活性化状態へ入るステップが阻害されている．さらにS4とS5にそれぞれ存在するフェニルアラニン残基が，S4が上がる際に立体障害となって「中間状態から活性化状態」のステップを遅くしていることもわかった8）．

同じ時期にマイアミ大学のグループが，VCFを適用することで蛍光強度変化の電位依存性を詳細に解析し，KCNE1がVSDの中間状態を安定化することを示した9）．つまり，KCNE1は単にVSDを上がりにくくしているのではなく，VSDが下がらないようにする効果も併せ持っていることになる．静止状態でも中間状態でもゲートは閉じており，電流は流れないので，静止状態に戻りにくくなることにどのような生理的意義があるのかは不明である．しかし，KCNE1によるゲーティング調節機構を理解する上で重要な発見であった．さらにその後，同じグループがKCNQ1を常時開状態にするKCNE3についても同様の実験を行い，KCNE3がVSDを活性化状態に安定化していることを示した10）．このように，VSDの“状態（state）”の安定化という観点から，KCNEによる多様なゲーティング調節機構を理解することができるようになりつつある．

3. KCNQ1–KCNE1複合体のストイキオメトリー

冒頭で紹介したとおり，KCNQ1チャネルは四量体の構造を持つ．KCNE1がどのようにKCNQ1に結合するのかについては，まだはっきりとしたことはわかっていないが，おそらく二つのVSDの間に入り込んでいるのではないかと予想されている．したがってKCNQ1チャネルには最大4か所のKCNE1結合部位が存在することになる（図1Bの円）．しかし，実際何分子のKCNE1が結合しているかに関しては議論が続いていた．

そこで我々は，KCNQ1のストイキオメトリーを決定する目的で，1分子蛍光イメージングを使った「サブユニットカウンティング法」を適用した11）．この方法では，まず数えたいイオンチャネルのサブユニットにGFPなどの蛍光タンパク質を融合させ，アフリカツメガエル卵母細胞に発現させる．それを全反射蛍光顕微鏡下で細胞膜近傍のみに励起光を当て，1分子レベルでのイメージングを行う（図3A）．すると，一つ一つのイオンチャネルは，1個の蛍光スポットとして観察される．そしてその一つにみえる蛍光スポットには，イオンチャネルサブユニットの数だけ蛍光タンパク質が存在していることになる．たとえばカリウムチャネルのように四量体であれば，サブユニットは4分子含まれていることになるので，蛍光タンパク質も4分子含まれていることになる．一方蛍光タンパク質には退色するという性質がある．蛍光を出していた分子が突如蛍光を発しない状態になってしまう現象で，不可逆過程である．細胞などで蛍光観察をしたことがある人ならば，励起光の強度・時間に応じて蛍光画像が徐々に暗くなってしまうという厄介な経験があるだろう．これを逆に利用し，1分子レベルでの退色イベントを数えることで一つのイオンチャネル複合体中に含まれるサブユニット数を数えることができる．この手法を用いることで，KCNQ1（四量体）に対し最大4分子のKCNE1が結合することを示した12）．またKCNQ1とKCNE1の相対的な発現密度に依存して，結合数が柔軟に変化しうるということもわかった（図3B）．

図3 1分子蛍光イメージングによるストイキオメトリーの決定

仮にKCNE1の結合数が発現密度に応じて柔軟に変化するとすれば，KCNE1の発現を調節することでKCNQ1チャネルの開閉のしやすさを制御している可能性がある．そしてさらにKCNE2～5といった他のKCNEタンパク質も同様に結合することができるため，複数種類のKCNEタンパク質が同時にKCNQ1に結合することも可能ということになる．また結合したKCNEの種類と数によってKCNQ1のゲーティングの性質が変わるので，実に多様な組み合わせ・性質を持ったKCNQ1-KCNE複合体が生じることになる．複合体は英語では“complex”であるが，この単語には“複雑”なという意味もある．KCNQ1チャネル複合体は実に複雑な制御を受けているといえよう13）．

4. おわりに

2017年に，クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析によるKCNQ1チャネルの立体構造が発表された14）．現在最も待ち望まれるのはKCNQ1–KCNE複合体の構造である．それが明らかになったときには，KCNEがどのようにKCNQ1のVSDと相互作用しているのか，そしてその結果VSDがどのような構造をとっているのかが詳細に明らかにされるだろう．

また別の課題として，前節で述べたような多様な複合体のストイキオメトリーが，生体内（心臓）で実際に起きているかどうかを明らかにする必要がある．本稿では詳しくふれなかったが，心臓にはKCNQ1以外にもhERG, Kv4など複数種類の電位依存性カリウムチャネルが存在し，それぞれが複数種類の補助サブユニットで制御されることが知られている．しかもKCNE2やKCNE3などは，KCNQ1だけではなくhERGやKv4とも結合し，制御することも知られている．したがって，これらのイオンチャネルサブユニットの発現や複合体構成を制御する機構が存在するのではないかと予想される．以上のことから，生体内におけるイオンチャネル複合体のありのままの姿を捉えることが複合体構成の制御メカニズムを明らかにするために必要であり，今後の課題である．

謝辞

本稿で紹介した研究成果は，生理学研究所の久保義弘研究室で行ったものです．久保教授をはじめ，多くの共同研究者の方々に感謝申し上げます．

1) Takumi, T., Ohkubo, H., & Nakanishi, S. (1988) Cloning of a membrane protein that induces a slow voltage-gated potassium current. Science, 242, 1042–1045.

2) Barhanin, J., Lesage, F., Guillemare, E., Fink, M., Lazdunski, M., & Romey, G. (1996) KVLQT1 and IsK (minK) proteins associate to form the IKs cardiac potassium current. Nature, 384, 78–80.

3) Sanguinetti, M.C., Curran, M.E., Zou, A., Shen, J., Spector, P.S., Atkinson, D.L., & Keating, M.T. (1996) Coassembly of KVLQT1 and minK (IsK) proteins to form cardiac IKs potassium channel. Nature, 384, 80–83.

4) Bendahhou, S., Marionneau, C., Haurogne, K., Larroque, M.M., Derand, R., Szuts, V., Escande, D., Demolombe, S., & Barhanin, J. (2005) In vitro molecular interactions and distribution of KCNE family with KCNQ1 in the human heart. Cardiovasc. Res., 67, 529–538.

5) Nakajo, K. & Kubo, Y. (2007) KCNE1 and KCNE3 stabilize and/or slow voltage sensing S4 segment of KCNQ1 channel. J. Gen. Physiol., 130, 269–281.

6) Mannuzzu, L.M., Moronne, M.M., & Isacoff, E.Y. (1996) Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science, 271, 213–216.

7) Osteen, J.D., Gonzalez, C., Sampson, K.J., Iyer, V., Rebolledo, S., Larsson, H.P., & Kass, R.S. (2010) KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 22710–22715.

8) Nakajo, K. & Kubo, Y. (2014) Steric hindrance between S4 and S5 of the KCNQ1/KCNE1 channel hampers pore opening. Nat. Commun., 5, 4100.

9) Barro-Soria, R., Rebolledo, S., Liin, S.I., Perez, M.E., Sampson, K.J., Kass, R.S., & Larsson, H.P. (2014) KCNE1 divides the voltage sensor movement in KCNQ1/KCNE1 channels into two steps. Nat. Commun., 5, 3750.

10) Barro-Soria, R., Perez, M.E., & Larsson, H.P. (2015) KCNE3 acts by promoting voltage sensor activation in KCNQ1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, E7286–E7292.

11) Ulbrich, M.H. & Isacoff, E.Y. (2007) Subunit counting in membrane-bound proteins. Nat. Methods, 4, 319–321.

12) Nakajo, K., Ulbrich, M.H., Kubo, Y., & Isacoff, E.Y. (2010) Stoichiometry of the KCNQ1–KCNE1 ion channel complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 18862–18867.

13) Osteen, J.D., Sampson, K.J., & Kass, R.S. (2010) The cardiac IKs channel, complex indeed. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 18751–18752.

14) Sun, J. & MacKinnon, R. (2017) Cryo-EM Structure of a KCNQ1/CaM Complex Reveals Insights into Congenital Long QT Syndrome. Cell, 169, 1042–1050.

中條 浩一（なかじょう こういち）

自治医科大学医学部生理学講座統合生理学部門教授．博士（学術）．

略歴 ◇ 1973年京都府生まれ．97年東京大学教養学部基礎科学科第一卒業．2002年同大学院総合文化研究科博士課程修了．05年生理学研究所助手（のち助教）．15年大阪医科大学医学部准教授．18年より現職．

研究テーマと抱負 ◇ イオンチャネルの構造機能連関．特に補助サブユニットによる電位依存性カリウムチャネルの機能調節メカニズム．イオンチャネルの性質や機能が，生体内での生理機能にどのように役立つかを明らかにしたい．

趣味 ◇ スポーツ観戦．