総説

p62/SQSTM1 ：オートファジーにおけるその役割

一村 義信・小松 雅明

順天堂大学医学部生理学第二講座 ◇ 〒113–8421　東京都文京区本郷2–1–1

p62/SQSTM1はユビキチン鎖を認識して特異的なタンパク質や細胞小器官（オルガネラ）をオートファジーへと導く受容体タンパク質である．p62/SQSTM1の機能解析によりオートファゴソーム局在タンパク質LC3との直接相互作用やLIRと呼ばれるLC3との相互作用領域などが明らかになり，現在の受容体タンパク質としての基本的条件が確立された．また，ユビキチン鎖との結合により相分離することや，p62/SQSTM1依存的な選択的オートファジーと連動した酸化ストレス応答システムKeap1-Nrf2経路の活性化機構が明らかになった．さらに，p62/SQSTM1の過剰蓄積が肝特異的オートファジー欠損マウスの肝障害や肝腫瘍の原因となることが遺伝学的に証明された．現在までに多数の受容体タンパク質が同定されているが，p62/SQSTM1はその分子動態や細胞制御の点からオートファジー分野において最も注目されている分子の一つである．

1. はじめに

p62/SQSTM1（以降はp62と省略）タンパク質をコードするSQSTM1遺伝子は後生動物（植物ではp62とNbr1のハイブリッド型が存在）に保存され，その発現は酸化ストレス，炎症性ストレス，代謝ストレスにより活性化されるNrf2, NF-κBおよびMiT/TFEなどの転写因子により制御される1–3）．p62は，N末端のPhox1およびBem1pドメイン（Phox1 and Bem1p：PB1），ジンクフィンガー（Zinc finger：ZZ），TRAF6結合モチーフ（TRAF6-binding domain：TB），LC3相互作用領域（LC3-interacting region：LIR），Keap1相互作用領域（Keap1-interacting region：KIR），およびC末端のユビキチン会合ドメイン（ubiquitin-associated：UBA）といった多数のドメインを有するタンパク質である（図1）．少なくともマウスにおいては，pre-mRNAのスプライシングによりKIRを欠いたp62バリアントの発現も認められる4）．通常，大部分のp62は細胞質や核に散在性に局在するが，一部斑点様構造体として観察される5）．p62の半減期は10時間程度であり，特殊な条件下を除いてオートファジー依存的に分解される6）．本稿では，p62と選択的オートファジーの関連を中心に解説する．シグナル伝達ハブとしてのp62の機能あるいはp62とヒト疾患との関連については他稿を参照いただきたい7, 8）．

図1 p62のドメイン構造

2. 選択的オートファジー

オートファジーは，細胞成分のリソソームまたは液胞での分解と定義される．その様式の違いからマクロオートファジー，ミクロオートファジー，そして膜透過型オートファジーなどに分けられる．そのうちの一つ，マクロオートファジー（以降は単にオートファジーとする）は，小胞体ないしはその近傍の構造体から出現した隔離膜が伸長して細胞質成分を取り囲んだオートファゴソームが形成される過程と，生じたオートファゴソームがエンドソームないしはリソソームと融合し内容物を消化する二つの過程から構成されている．15のコアATG遺伝子産物が協調的，連続的に働くことでオートファゴソームが形成される9）（図2A）．

図2 オートファジー

栄養飢餓誘導型のオートファジーでは無作為に細胞質成分を分解すると考えられている一方，ある状況下では特定の積み荷（カーゴ）をオートファゴソームが選択的に取り囲み，分解する．後者は選択的オートファジーと呼ばれ，特定の可溶性タンパク質，タンパク質凝集体，不要なオルガネラ，病原性細菌を分解することで細胞の恒常性維持に貢献している10）．通常のオートファジーと選択的オートファジーにおけるオートファゴソーム膜形成の分子機構は共通であると考えられるが，選択的オートファジーではストレスに応じた「各カーゴの標識」や「受容体タンパク質」により選択性が担保される．「各カーゴの標識」とは，カーゴのユビキチン化や受容体タンパク質のカーゴへの局在化を意味する．一方，「受容体タンパク質」は，カーゴとオートファゴソーム局在タンパク質LC3ないしはGABARAPファミリーに結合するタンパク質群を指す．受容体タンパク質は，カーゴのユビキチン鎖を認識するユビキチン結合型受容体タンパク質と分解カーゴ上に局在するカーゴ局在型受容体タンパク質の二つに分けられる（図2B，表1）．いずれのタイプの受容体タンパク質もLIRを有しており，オートファゴソーム膜に局在するLC3ないしはGABARAPファミリーに，あるいは両ファミリーに直接結合する（表1）．LIRの翻訳後修飾による制御も存在する．細胞内侵入細菌やミトコンドリアの受容体タンパク質であるOptineurinやNix/Bnip3Lは，LIRの直前に存在するセリン残基のリン酸化によりLC3との相互作用が増強する11, 12）．また，LC3ないしはGABARAPに特異的に結合する受容体タンパク質も同定されており13），LC3のホモログに使い分けがあることもわかってきた．しかし，哺乳動物Atg8ホモログをすべて欠損したHeLa細胞においても，脱分極したミトコンドリアをオートファゴソームが隔離する像が観察されている14）．このことは，少なくともマイトファジーにおいては受容体タンパク質群とLC3ないしはGABARAPとの相互作用は必須でないことを意味する．受容体タンパク質はオートファゴソーム形成に必須な上流因子（たとえばFIP200など）との相互作用も示唆されており，LC3やGABARAPとの相互作用は補完的な役割を担う可能性も残る．

3. p62とオートファジーの接点

2005年にTerje Johansenにより，p62はユビキチン化凝集体を隔離膜へ導く受容体タンパク質として機能することが提唱された5）．p62は初めて同定された受容体タンパク質であり，この報告以降に選択的オートファジーが注目されるようになった．2007年，著者らはp62が直接LC3と相互作用すること，そしてオートファジー欠損マウス組織において顕著に蓄積し，ユビキチン化タンパク質とともに凝集体様の構造体を形成することを報告した15）．さらに，2007年のJohansenらの生化学的解析，そして2008年の著者らのX線結晶構造解析から，p62はDDDWTHL配列（初めて同定されたLIR配列）を介して直接LC3と結合することが判明した6, 16）．その後，p62は脱分極したミトコンドリアや細胞内侵入細菌などをユビキチン鎖を介して認識し，それら積み荷（カーゴ）をLC3との相互作用を介して隔離膜に運ぶ受容体タンパク質としての機能が続々と報告された17–19）．2010年には，著者やJohansenを含めた複数のグループが独立に，オートファジーカーゴ上でp62がCullin 3型ユビキチンリガーゼのアダプタータンパク質Keap1と直接に相互作用し，酸化ストレス応答のマスター転写因子であるNrf2を活性化する仕組みを明らかにした20–22）．さらに，2018年，Yuらはp62がユビキチン結合依存的に相分離することを示し，相分離したp62構造体の境界に沿って隔離膜が形成されることが提唱された23）．p62は，その分子動態や細胞制御の点からも分子細胞生物学において注目されている分子の一つであり，その研究，少なくともオートファジーとの関連は，Johansenと著者らのグループが牽引してきた（図3）．

図3 Terje Johansen博士（左）と小松（右）

4. p62介在性選択的オートファジーの分子機構

ここでは信頼性の高いいくつかの論文を統合し，p62介在性選択的オートファジーの分子機構を紹介する．通常状態では，p62は，UBAドメインどうしの会合によりユビキチン鎖と相互作用ができない24, 25）．また，N末端のPB1ドメインに存在するLys7とAsp69の間の静電的相互作用によるhead-to-tailの自己相互作用によりらせん状フィラメントを形成している26）（図4）．プロテオスターシス（タンパク質恒常性維持機構）の異常などに応じてUBAドメイン内の407番目のセリン残基がULK1によりリン酸化されると，UBAドメインどうしの会合が解除されユビキチン鎖と結合可能となる27）．その後，ULK1，カゼインキナーゼ2またはTANK結合キナーゼ1により403番目のセリン残基がリン酸化されると，p62とユビキチン鎖との結合が増強する28–30）（図4）．ユビキチン鎖の結合によりp62のらせん状フィラメントは断片化し，相分離し，液体様の性質を維持したまま細胞質内に濃縮（相分離）する23, 31）（図4）．最終的に，相分離したp62の境界面に沿って隔離膜が形成され，LC3との相互作用依存的にオートファジーにより分解されると考えられる（図4）．興味深いことに，p62と同様のドメイン構造を持つ受容体タンパク質NBR1の存在下でp62の相分離が促進される31）．おそらく，p62フィラメント断片が相分離する過程においてNBR1はp62に作用すると考えられる．

図4 p62介在性選択的オートファジーの分子機構

5. p62介在性オートファジーとKeap1-Nrf2経路

主要な酸化ストレス応答機構であるKeap1-Nrf2システムにおいて，Keap1はユビキチンリガーゼ（正確にはCullin 3型ユビキチンリガーゼのアダプタータンパク質）として働き，Nrf2は転写因子として生体防御酵素群の遺伝子発現を調節する32）．すなわち細胞が活性酸素や親電子性物質などのストレスにさらされると，Keap1がセンサーとして働き，Nrf2の分解を停止して，Nrf2が活性化する．その結果，Nrf2は核内へ移行して，抗酸化タンパク質や抗炎症性酵素の遺伝子発現を誘導し細胞を保護する．Nrf2のKeap1によるユビキチン化には蝶番と閂（かんぬき）モデルが提唱されている32, 33）（図5A）．Nrf2のNeh2ドメインと呼ばれる領域にあるDLGex領域とETGE配列それぞれがKeap1のβ-プロペラ構造の底面にある同じ領域に結合する．1分子のNrf2がKeap1ホモ二量体により認識されるのである．この2か所の結合はNrf2のDLGex領域とETGE配列の間に存在するリシン残基のユビキチン化に不可欠である34）．蝶番として機能するETGE配列はKeap1と強固に結合し，閂として働くDLGex領域の結合はETGE配列に比して弱い34）．ストレスによりKeap1のシステイン残基が酸化修飾を受けるとDLGex領域との相互作用が解除され，Nrf2のユビキチン化が抑制されると考えられている（図5A）．一方，p62はKeap1と直接に相互作用するモチーフKIRを有する．KIRは，LIRの直下に存在する344から356番目のKEVDPSTGELQSL配列を指す（図1）．KIRは，STGE配列を介してNrf2が結合するKeap1のβ-プロペラ構造の底面に競合的に結合する．p62のKIRとKeap1との結合様式はNrf2のETGE配列とKeap1とのそれに酷似しているが，その親和性は低い35）．これは，Nrf2-ETGE配列のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基がKIRの場合セリン残基（S349）になっていることに起因する．著者らは，このS349がリン酸化されることを見いだした．このリン酸化によりKIRのKeap1への親和性は30倍以上高まり，おそらくNrf2のDLGex領域とKeap1との結合を競合的に阻害し，Nrf2の分解を抑制し，Nrf2の活性化を導くと考えられる35）（図5B）．S349のリン酸化はユビキチン鎖と結合できないF408V変異体や多量体を形成できないK7A D69A変異体ではほとんど起こらないことから，相分離が先だって必要なのかもしれない36）．つまり，p62がユビキチンと結合した場合にのみNrf2が活性化する．相分離は核小体，P顆粒，ストレス顆粒のような膜を持たないオルガネラだけでなく，アクチン重合の活性化に応答して形成される細胞内シグナリングハブのような一過性の構造体形成にも関わっている37, 38）．したがって，相分離したp62はNrf2活性化のシグナリングハブとして機能し，それを標的とするオートファジーはNrf2シグナルを解除する役割を持つのかもしれない．Nrf2の標的遺伝子は，抗酸化タンパク質や抗炎症性酵素のみならずAtgタンパク質やプロテアソームサブユニットの遺伝子発現をも誘導し，タンパク質恒常性維持に貢献する．p62遺伝子もNrf2の標的遺伝子の一つであることから，ポジティブフィードバック機構が存在する1）．

図5 Nrf2活性化機構

6. オートファジー欠損マウスの表現型とp62

1か月間肝臓においてオートファジー必須遺伝子Atg7を欠損させたマウスは，肝実質細胞の膨張を伴った重篤な肝腫大，肝機能障害を引き起こす．その肝実質細胞内には，変形したミトコンドリア，ペルオキシソーム，小胞体に取り囲まれた脂肪滴が蓄積していた39）．前述のとおり，変異肝実質細胞においてp62とユビキチン化タンパク質が著しく蓄積しており，多数のp62およびユビキチン陽性の構造体も観察された．マウス肝臓においてオートファジーの長期的な抑制は腫瘍形成を起こす．全身性にオートファジー必須遺伝子Atg5をモザイク状に欠損させたマウスや肝臓特異的Atg7欠損マウスは，7か月から9か月齢で小さな腫瘍が肝臓で検出される40, 41）．加齢とともに，腫瘍の数，大きさは増加し，16か月から19か月齢には肝臓はほぼ腫瘍で覆われる40, 41）．長期的にオートファジーを欠いた肝実質細胞は機能を消失した異常ミトコンドリアを蓄積しており，酸化ストレスを被っていた．その結果，ゲノム不安定性が生じ，腫瘍化すると想定される．Atg5ないしはAtg7欠損で確認される腫瘍は転移能のない良性腫瘍でとどまることから，オートファジーには腫瘍抑制効果がある一方，腫瘍の悪性化にはオートファジー活性が必要なのかもしれない40, 41）．重要なことに，オートファジー欠損マウス肝臓においてp62ないしはNrf2を同時に欠損させると，肝腫大や肝機能障害が大幅に改善された21, 42）．つまり，オートファジー不全マウス肝臓では，持続的なNrf2の活性化が主たる病因であるといえる．一方，Atg7およびp62を二重欠損させたマウス肝実質細胞においても，Atg7欠損マウス肝実質細胞同様に異常なオルガネラが蓄積し，12か月齢で腫瘍形成も確認された41）．しかし，腫瘍増殖は著しく抑制されていた．肺線がんなど恒常的にNrf2を活性化しているがん細胞は，Nrf2が酸化ストレス応答性遺伝子のみならず，ペントースリン酸経路，プリンヌクレオチド合成経路やグルタミノリシスを制御する酵素群の遺伝子発現も誘導し，これらが腫瘍増殖を支える43）．同様に，オートファジー欠損マウス肝臓ではNrf2の恒常的な活性化により腫瘍細胞の増殖を促進するグルコース，グルタミンの代謝の再編成が起こっていた44）．

7. おわりに

酵母の液胞酵素であるApe1は，前駆体として細胞質で合成され，Atg19を受容体タンパク質とする選択的オートファジー（Cvt経路）により液胞へ運ばれる．Ape1前駆体はそれ自身で巨大な多量体を形成するが，Atg19が結合することで多量体形成が抑制され，選択的オートファジーで輸送可能なサイズへ調整される45）．この制御過程にもApe1の相分離の関与が想像される．RNAとタンパク質からなる構造体である線虫のP顆粒は，分化の過程でSEPA1を受容体タンパク質とする選択的オートファジーにより分解され，生殖細胞にのみ維持される．最近，P顆粒が相分離により形成されることが明らかにされ，そのシグナルにmTORC1，促進因子にP顆粒を構成するPGL-1, PGL-3そしてSEPA-1，サイズを決定する因子としてEPG-2が同定された46）．さらに，栄養飢餓に応じてリボソームがオートファジーにより分解されることが明らかにされているが，mTORC1の不活化によりリボソームの相分離が起こることが報告された47）．これらの事実は，選択的オートファジーにおいて相分離は，カーゴを運命づけるための普遍的な機構であることを示唆している．一方，現在のところ，オートファゴソーム形成装置（コアAtgタンパク質）がどのようにして相分離したカーゴの近傍に集まるのか，そしてどのようにして相分離の境界面で隔離膜が形成されるのかは不明であり，今後の研究で明らかにする必要がある．

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小松 雅明（こまつ まさあき）

順天堂大学医学部生理学第二講座教授．医学博士．

略歴 ◇ 1972年新潟県に生る．95年明治大学農学部卒業．2010年東京都医学総合研究所タンパク質リサイクルプロジェクトプロジェクトリーダー．14年新潟大学医学部分子遺伝学（旧生化学第一）教授．18年より現職．

研究テーマと抱負 ◇ 選択的オートファジーの分子機構と生理機能の解明．ユビキチン様結合反応系Ufm1システムの包括的研究．学部を問わず大学院生を広く募集中です．

ウェブサイト ◇ https://www.juntendo.ac.jp/graduate/laboratory/labo/kikan_saibou/jpn/members/

趣味 ◇ 散策．