みにれびゅう

ファゴサイトーシスにおけるSNAP-23の役割と制御機構

櫻井 千恵・初沢 清隆

国立大学法人鳥取大学医学部生命科学科 ◇ 〒683–8503　鳥取県米子市西町86

1. はじめに

ファゴサイトーシスはエンドサイトーシスの一種で，マクロファージなどの食細胞にみられる比較的大きな標的物（0.5 µm以上）の取り込み反応である．これは自然免疫反応の一つであり，標的物（アポトーシス小体や外来異物など）の表面分子に特異的な受容体によって引き起こされる．取り込みにより形成されたファゴソームは，時間経過とともに活性酸素種の産生，酸性化，酸性加水分解酵素群の集積などにより，内部環境が変化しファゴリソソームへと成熟する．膜の動きに着目すると，取り込みに必要な膜成分は細胞内部から細胞膜へ，また成熟化に伴いエンドソームやリソソームから各種成分はファゴソームへ小胞輸送される．いずれも複雑な膜融合反応の関与が予想されるが，詳細については未解明な点が多い．本稿では，膜融合装置SNAREタンパク質の一つSNAP-23（synaptosomal-associated protein of 23 kDa）のファゴサイトーシスにおける役割と制御機構について，筆者らの最近の研究成果を中心に紹介する．

2. ファゴサイトーシスを制御するSNAREタンパク質

1）SNAREタンパク質

SNARE（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor）タンパク質は，多くの細胞内小胞輸送において二つの膜の融合を担う分子であり，syntaxin, SNAP-25, VAMPの三つのファミリーからなる．これらがSNARE複合体を形成した場合，引き合う力が生じ膜融合が起こる．この複合体形成にはSNAREモチーフと呼ばれる領域が重要である．この中心のアミノ酸残基がグルタミン（Q）であるものをQ-SNARE，アルギニン（R）の場合をR-SNAREと呼ぶ．syntaxinはQa-SNARE, SNAP-25は2か所有するためQbc-SNARE, VAMPはR-SNAREに分類され，SNARE複合体は四つのSNAREモチーフ（Qa, Qb, Qc, R）からなるbundle構造をとる．詳細な機構は他の総説を参照いただきたい1）．

2）これまでの知見（表1を参照）

表1 ファゴソーム形成と成熟に機能するSNAREタンパク質

ファゴソーム形成の際，内部のオルガネラやそれら由来の小胞が細胞膜に融合し膜成分が供給される．Fc受容体依存性のファゴサイトーシスでは，このステップに機能するSNAREタンパク質としてリサイクリングエンドソーム（RE）局在VAMP3と後期エンドソーム（LE）局在VAMP7が報告された2）．樹状細胞による大腸菌のファゴサイトーシスの場合には，LE・リソソーム（LY）局在のVAMP8が抑制的に働く3）．同様に，Fc受容体やアポトーシス小体認識受容体によるファゴソーム形成を抑制するものには，細胞膜（PM）局在のsyntaxin11（stx11）がある4）（stx11のノックアウト解析から，ファゴソーム形成に関与しないとの報告もある5））．筆者らは，Fc受容体依存性の場合，小胞体（ER）局在のsyntaxin18が機能すること，また通常その機能はSec22bによって抑制されていることを明らかにした6, 7）．さて，このようにQa-, R-SNAREタンパク質が同定されていたのに対し，細胞膜上のQbc-SNAREタンパク質は明確ではなかった．一方，ファゴソームの成熟の際は，その初期に初期エンドソーム（EE）局在のsyntaxin13，その後にLE局在のsyntaxin7がそれぞれの小胞とファゴソームとの融合に機能する8）．また，樹状細胞では，VAMP3とVAMP8が大腸菌を含むファゴソームの成熟に働き，抗原提示の効率化に関与する9）．しかし，いずれの場合もファゴソーム膜上で働くSNAREタンパク質は同定されていなかった．

3. ファゴサイトーシスにおけるSNAREタンパク質SNAP-23の役割

1）SNAP-23の構造的特徴と一般的な機能

SNAP-23は多くの細胞種において主に細胞膜に局在するSNAREタンパク質であり，エキソサイトーシスに機能する．分子内に二つのSNAREモチーフ（Qbc）を持ち，また，これらにはさまれた領域に密集する五つのシステイン残基がパルミトイル化され膜に結合している．種間で保存されたSer23, Thr24, Ser95, Ser110, Ser160（または161）の1か所以上がリン酸化されることで，SNARE複合体形成とそれに伴うエキソサイトーシスが制御される．リン酸化・脱リン酸化は刺激に応じて起こるが，リン酸化部位やエキソサイトーシスの制御は細胞種によって異なる10, 11）．

SNAP-23は，ファゴサイトーシスの際に細胞膜で機能するSNAREタンパク質として想定されていたが，その機能は未解明だった．

2）SNAP-23のファゴソーム形成における機能

SNAP-23のファゴサイトーシス時の機能を調べるにあたり，IgGでオプソニン化した（IgG-）ザイモサン（酵母の細胞壁画分）やラテックスビーズをマクロファージに与えたところ，いずれのファゴソーム膜にもSNAP-23の局在化が観察された．筆者らはファゴソーム形成におけるSNAP-23の機能解析のため，マクロファージにIgG-ザイモサンを与え，その取り込み効率を測定した．その結果，SNAP-23の過剰発現マクロファージでは取り込み効率，すなわちファゴソーム形成効率に顕著な増加がみられ，一方，SNAP-23発現を抑制した場合では効率は減少した．これらから，SNAP-23はファゴソーム形成の促進に機能すると考えられた12）．

3）SNAP-23のファゴソーム成熟における機能

形成されたファゴソームは，順次オルガネラと融合することでファゴリソソームへと成熟する．次に，筆者らはこの成熟過程におけるSNAP-23の機能を解析するため，マクロファージにIgG-ラテックスビーズを与え形成させたファゴソームをショ糖密度勾配遠心分離法により単離し，成熟化の指標となるファゴソーム局在化タンパク質について調べた．その結果，SNAP-23過剰発現マクロファージでは，活性酸素種の産生を担うNADPHオキシダーゼ複合体の形成因子gp91phoxやp22phoxの局在量が増加していた．また，LAMP-1（LY局在）や液胞型ATPアーゼ（LY関連オルガネラ局在）の局在量の増加もみられた．続いて，ファゴソーム内部の酸性化とファゴソーム-リソソームの融合効率を調べたところ，いずれもSNAP-23の過剰発現により亢進し，反対に発現抑制により低下した．この低下はSNAP-23の過剰発現によりレスキューされた．以上から，SNAP-23はファゴソーム形成だけでなく成熟の過程にも機能することがわかった12）．

SNAP-23は，SNARE複合体形成時には立体構造が大きく変化しコンパクトになる（図1A）．そこで，実際に膜上で働くようす，つまり複合体形成による構造変化を捉えるため，SNAP-23の一分子フェルスター共鳴エネルギー移動（Förster resonance energy transfer：FRET）プローブを作製した．複合体形成時に近接するSNAP-23の二つのSNAREモチーフのN末端それぞれに蛍光タンパク質TagGFP2とTagRFPを挿入し，ファゴソーム膜上のFRETシグナルを解析した．その結果，このプローブとVAMP7を共発現させた場合にシグナルの増加が観察された（図1B）．この結果は，SNAP-23がファゴソーム膜上でSNARE複合体を形成し膜融合に機能すること，この複合体の形成因子にはVAMP7が含まれることを示唆する12）．

図1 ファゴソーム膜上SNAP-23の一分子FRET解析

4. ファゴサイトーシスにおけるSNAP-23の機能制御

1）SNAP-23 Ser95のリン酸化によるファゴサイトーシスへの影響

これまでの結果から，SNAP-23はファゴソームの形成と成熟という連続する複数のステップで機能することがわかった．では，その機能はどのように制御されているのだろうか．それを調べるため，筆者らはSNAP-23のリン酸化に着目した．実際，マクロファージのファゴソームには，リン酸化されたSNAP-23が存在することがわかっている．今回は，種間で保存され，またマスト細胞や血小板においてエキソサイトーシスを亢進するなどの報告があるSNAP-23の95番目のセリン残基（Ser95）に着目した10）．

SNAP-23のSer95リン酸化型変異体を作製しファゴサイトーシスへの影響を調べたところ，リン酸化型変異体はIgG-標的物を含むファゴソームの形成と成熟のいずれも阻害した．さらにリン酸化型変異を導入したSNAP-23の一分子FRETプローブを用いて細胞膜上のFRETシグナルを解析したところ，定常状態においてFRETシグナルの上昇が観察された．これは野生型や非リン酸化型のFRETプローブではみられないことから，SNAP-23はSer95のリン酸化によってコンパクトな構造をとりやすくなると推測された．おそらく，この構造変化したSNAP-23が，Fc受容体依存性のファゴサイトーシスに働くSNARE複合体の形成阻害を引き起こすことで，ファゴソームの形成と成熟の効率の低下が生じると考えられる（図2）13）．

図2 Ser95リン酸化SNAP-23によるファゴサイトーシス制御機構

2）ファゴソーム成熟におけるSNAP-23 Ser95のリン酸化調節

I-κBキナーゼ（inhibitor-κB kinase：IKK）は，転写因子NF-κBの活性化に関与するリン酸化酵素群である．そのサブユニットIKK2は，マウスSNAP-23のSer95とSer120をリン酸化することでエキソサイトーシスを制御する10）．筆者らはIKK2とSNAP-23のFRETプローブをマクロファージに共発現し，そのFRETシグナルを測定した．すると，細胞膜ではシグナルの変化はみられなかった一方，ファゴソーム膜上ではIKK2に依存するシグナルの増加が検出できた．この増加は，IKK2阻害剤の存在下では顕著に減弱した．また，IKK2の過剰発現はファゴソーム成熟を抑制することがわかった．以上から，IKK2はファゴソーム膜上のSNAP-23のリン酸化酵素の一つであると考えられる13）．

サイトカインの一種であるインターフェロンγ（interferon-γ：IFN-γ）刺激を受けたマクロファージでは，ファゴソーム成熟は抑制される．リン酸化SNAP-23の生理的意義を調べるため，IFN-γ刺激時のファゴソーム膜上のFRETシグナルを解析したところ，定常状態に比べSer95依存的なシグナルの増加が観察された．また，IFN-γ刺激時のファゴソーム成熟の抑制は，IKK2阻害剤の存在下では解消された．以上の結果から，IFN-γ刺激時のファゴソーム成熟の抑制には，IKK2依存的なSer95リン酸化SNAP-23が関与することが明らかになった（図2）13）．

5. おわりに

本稿で紹介したSNAP-23の機能は，マクロファージが持つ緊急事態への応答の一つと考えられる．通常，SNAP-23は主にさまざまなエキソサイトーシスに関与する．また最近，筆者らはリポ多糖をリガンドとするToll様受容体4（TLR4）の細胞内リサイクリングにも機能することを見いだしている14）．SNAP-23の多様な機能は，そのパートナーSNAREタンパク質の切り替えで実現され，またその切り替え制御の一つとして，今回紹介したSNAP-23のリン酸化が関与すると考えられる．また，SNAP-23では明らかになっていないが，同じQbc-SNAREであるSNAP-29のようにO結合型β-N-アセチルグルコサミン付加等による別の制御もあるかもしれない15）．

予備的実験から，Fc受容体とTLR4に依存するそれぞれのファゴサイトーシス効率がSNAP-23のリン酸化状態で相反する結果を得ている．これは，表面分子の異なる標的物が混在する際に，宿主にとって危険度の高いものから優先的に取り込む調節機構なのかもしれない．また，SNAP-23によるファゴソーム内部環境の制御は，抗原提示されるペプチド断片のプロセシングに影響すると考えられる9）．このようなファゴサイトーシスにおけるさまざまな生理機能を理解するため，今後，個々の受容体によるSNAP-23をとりまく膜輸送系とその制御機構の解明を進めていきたい．

1) Hong, W. & Lev, S. (2014) Tethering the assembly of SNARE complexes. Trends Cell Biol., 24, 35–43.

2) Braun, V., Fraisier, V., Raposo, G., Hurbain, I., Sibarita, J.B., Chavrier, P., Galli, T., & Niedergang, F. (2004) TI-VAMP/VAMP7 is required for optimal phagocytosis of opsonised particles in macrophages. EMBO J., 23, 4166–4176.

3) Ho, Y.H., Cai, D.T., Wang, C.C., Huang, D., & Wong, S.H. (2008) Vesicle-associated membrane protein-8/endobrevin negatively regulates phagocytosis of bacteria in dendritic cells. J. Immunol., 180, 3148–3157.

4) Zhang, S., Ma, D., Wang, X., Celkan, T., Nordenskjold, M., Henter, J.I., Fadeel, B., & Zheng, C. (2008) Syntaxin-11 is expressed in primary human monocytes/macrophages and acts as a negative regulator of macrophage engulfment of apoptotic cells and IgG-opsonized target cells. Br. J. Haematol., 142, 469–479.

5) D’Orlando, O., Zhao, F., Kasper, B., Orinska, Z., Muller, J., Hermans-Borgmeyer, I., Griffiths, G.M., Zur Stadt, U., & Bulfone-Paus, S. (2013) Syntaxin 11 is required for NK and CD8⁺ T-cell cytotoxicity and neutrophil degranulation. Eur. J. Immunol., 43, 194–208.

6) Hatsuzawa, K., Tamura, T., Hashimoto, H., Hashimoto, H., Yokoya, S., Miura, M., Nagaya, H., & Wada, I. (2006) Involvement of syntaxin 18, an endoplasmic reticulum (ER)-localized SNARE protein, in ER-mediated phagocytosis. Mol. Biol. Cell, 17, 3964–3977.

7) Hatsuzawa, K., Hashimoto, H., Hashimoto, H., Arai, S., Tamura, T., Higa-Nishiyama, A., & Wada, I. (2009) Sec22b is a negative regulator of phagocytosis in macrophages. Mol. Biol. Cell, 20, 4435–4443.

8) Collins, R.F., Schreiber, A.D., Grinstein, S., & Trimble, W.S. (2002) Syntaxins 13 and 7 function at distinct steps during phagocytosis. J. Immunol., 169, 3250–3256.

9) Nair-Gupta, P., Baccarini, A., Tung, N., Seyffer, F., Florey, O., Huang, Y., Banerjee, M., Overholtzer, M., Roche, P.A., Tampe, R., et al. (2014) TLR signals induce phagosomal MHC-I delivery from the endosomal recycling compartment to allow cross-presentation. Cell, 158, 506–521.

10) Suzuki, K. & Verma, I.M. (2008) Phosphorylation of SNAP-23 by IkappaB kinase 2 regulates mast cell degranulation. Cell, 134, 485–495.

11) Yasuda, K., Itakura, M., Aoyagi, K., Sugaya, T., Nagata, E., Ihara, H., & Takahashi, M. (2011) PKC-dependent inhibition of CA2+-dependent exocytosis from astrocytes. Glia, 59, 143–151.

12) Sakurai, C., Hashimoto, H., Nakanishi, H., Arai, S., Wada, Y., Sun-Wada, G.H., Wada, I., & Hatsuzawa, K. (2012) SNAP-23 regulates phagosome formation and maturation in macrophages. Mol. Biol. Cell, 23, 4849–4863.

13) Sakurai, C., Itakura, M., Kinoshita, D., Arai, S., Hashimoto, H., Wada, I., & Hatsuzawa, K. (2018) Phosphorylation of SNAP-23 at Ser95 causes a structural alteration and negatively regulates Fc receptor-mediated phagosome formation and maturation in macrophages. Mol. Biol. Cell, 29, 1753–1762.

14) Kinoshita, D., Sakurai, C., Morita, M., Tsunematsu, M., Hori, N., & Hatsuzawa, K. (2019) Syntaxin 11 regulates the stimulus-dependent transport of Toll-like receptor 4 to the plasma membrane by cooperating with SNAP-23 in macrophages. Mol. Biol. Cell, 30, 1085–1097.

15) Guo, B., Liang, Q., Li, L., Hu, Z., Wu, F., Zhang, P., Ma, Y., Zhao, B., Kovacs, A.L., Zhang, Z., et al. (2014) O-GlcNAc-modification of SNAP-29 regulates autophagosome maturation. Nat. Cell Biol., 16, 1215–1226.

櫻井 千恵（さくらい ちえ）

鳥取大学医学部生命科学科分子細胞生物学講座分子生物学分野助教．博士（医学）．

略歴 ◇ 2008年山形大学理学部卒業．14年福島県立医科大学大学院医学研究科博士課程修了．12年福島県立医科大学医学部助手，助教を経て，14年より現職．

研究テーマと抱負 ◇ 細胞内での膜融合反応，特にマクロファージを用いた自然免疫反応における膜融合反応とその制御機構を解明し，臨床応用につなげたい．

初沢 清隆（はつざわ きよたか）

鳥取大学医学部生命科学科分子細胞生物学講座分子生物学分野教授．博士（農学）．

略歴 ◇ 2013年より現職．