みにれびゅう

誘導性アンフィソームはインフルエンザウイルス感染防御に働く

近江 純平¹⁾・西川 喜代孝²⁾

¹⁾ 東京大学大学院薬学系研究科衛生化学教室　特任助教 ◇ 〒113–0033 東京都文京区本郷7–3–1

²⁾ 同志社大学大学院生命医科学研究科分子生命化学　教授 ◇ 〒610–0321 京都府京田辺市多々羅都谷1–3

1. はじめに

細菌やウイルスなどの病原微生物は，生存戦略として宿主細胞の分子機構を巧みに利用することで効率よく増殖し，病原性を発揮する．その一方で，宿主細胞には病原微生物に対抗するための防御機構が存在する．近年，宿主細胞内のさまざまなオルガネラが，病原微生物-宿主間相互作用の主たる場として固有の機能を有することが明らかになってきた1）．最近我々は，A型インフルエンザウイルス（IAV）のヘマグルチニン（HA）を標的として，強い抗IAV活性を示す4価型ペプチドを同定した．興味深いことに本ペプチドは親ウイルスのHAを標的とせず，感染成立後細胞内で新生されるHAに結合すること，その後オートファゴソーム様の特殊オルガネラの形成を誘導し，そこにHAを隔離することによりIAVの増殖を顕著に抑制すること，を見いだした2）．このことは，本誘導性オルガネラは生体が本来有している新たな防御機構である可能性を示している．本稿では，本オルガネラの形成機構とオートファジー経路との関連について概説するとともに，新たな病原微生物–宿主間相互作用の場としての本オルガネラの機能を紹介する．

2. 抗IAV活性を示す4価型HA結合ペプチドの同定

IAVは毎年大流行する季節性インフルエンザの主要な病原ウイルスであるとともに，時に世界的なパンデミックを引き起こすことから人類にとっていまだに大きな脅威である．IAVの感染サイクルは，（1）標的細胞への結合と侵入（感染初期），（2）ウイルスゲノムRNAとmRNAの合成（感染中期），（3）ウイルスタンパク質の新生，ならびに子ウイルスの形成・放出（感染後期），から構成されており，各段階に関わるウイルスタンパク質，ならびに宿主因子が抗IAV薬の創薬標的として注目されている．そこで我々は，感染初期において機能するIAVのエンベロープタンパク質の一つ，HAに対する阻害ペプチドの開発を試みた．

HAは標的細胞表面に存在する糖タンパク質あるいは糖脂質の糖鎖末端シアル酸を認識し，IAVの標的細胞への結合，さらにそれに続くウイルスエンベロープと細胞膜との膜融合に必須の役割を果たしている．この膜融合によってウイルスゲノムRNAが細胞質に放出される．HAはホモ三量体構造をとっており，一度に最大3分子のシアル酸と結合する．この多価型の相互作用により，1対1の結合と比較して結合親和性は数千倍亢進する．本現象は「クラスター効果」と呼ばれており，他にもコレラ毒素や志賀毒素などAB5型の細菌毒素が受容体を認識する際などに幅広く観察される3, 4）．我々はこれまでに，クラスター効果に基づく強力な相互作用を阻害する分子を同定する技術，多価型ペプチドライブラリー法を開発している3, 5）．本法では，クラスター効果を発揮して機能する標的分子に対して，それ自体がクラスター効果を発揮できるようにランダムペプチド部を4価で有するペプチドライブラリーを作製し，高親和性結合活性を指標にスクリーニングを行う．一般的な低分子化合物スクリーニングでは1対1の結合にしか適用できないため，このような分子の同定はきわめて困難である．そこで，HAの受容体結合部位を標的として本法を適用し，4価型高親和性HA結合ペプチド，PVF-tetを同定した（図1A）2）．PVF-tetは，HA結合モチーフとして，RRPVNHFの配列を4価で有するが，同配列のモノマー型ペプチドではHAに対する結合活性をまったく示さない．このことは，従来型のペプチドライブラリー法やファージディスプレイ法では本モチーフの同定は不可能であることを示している．

図1 4価型HAペプチドはHAを隔離することで抗IAV活性を示す

PVF-tetはMDCK細胞におけるIAVの増殖ならびに感染による細胞傷害を効率よく抑制し，さらにマウスを用いたH1N1 IAVの感染実験でも高い治癒効果を示した（図1B, C）．in vitroでは，PVF-tetはHAと受容体ミミックであるシアル酸ポリマーとの結合を効率よく阻害することが示された．しかしながら，予想に反してPVF-tetは親ウイルスの細胞内侵入をまったく阻害せず，細胞内での各種ウイルスタンパク質の産生も阻害しないこと，むしろHAの産生量は増加すること，を見いだした．そこでPVF-tetの作用機構の詳細を明らかにするため，IAV感染後期にPVF-tet処理した場合の効果を検討したところ，この場合でも十分な抗ウイルス活性を示すことが明らかとなった（図1D）．さらに，蛍光標識PVF-tetを用いて感染後新生される各種ウイルスタンパク質との共局在性を検討したところ，PVF-tetはHAとのみ共局在性を示すこと，この時HAは液胞様構造体中に蓄積していること，が示された（図1E）．以上のことから，PVF-tetはそれ自体が膜透過性を有しており，感染後新生されてくるHAの受容体結合部位に特異的に結合すること，その結果液胞様構造体の形成が誘導され，そこにHAを隔離することによりIAVの産生を強力に阻害すること，が明らかとなった．

3. 抗IAV活性を示す液胞様構造体の性状解析

PVF-tetにより形成誘導され，HAを蓄積・隔離する液胞様構造体について性状解析を行ったところ，1）本構造体には後期エンドソームやリソソームのマーカー分子であるLAMP-1やCathepsin Dが局在しており，酸性コンパートメントを染色するLysotackerで強染色されること，2）本構造体はコレステロールを染色するfilipin，ならびに細胞外から添加した蛍光セラミドで強く染色されること，が示された．このことは，本構造体が脂質に富んだリソソーム関連オルガネラであることを示している．

脂質に富んだリソソーム関連オルガネラとしては，肺胞II型上皮細胞内に多く存在するラメラボディーが知られている．このラメラボディーはリン脂質を主成分とする肺サーファクタントを肺胞内に供給するためのオルガネラであり，限界膜に局在するリン脂質トランスポーター，ABCA3の脂質輸送活性によって後期エンドソームから成熟して形成される6）．そこで，ABCA3をMDCK細胞に高発現させ，ラメラボディーを恒常的に産生する細胞株を樹立し，IAV感染に対する効果を検討した．その結果，本細胞株はPVF-tet非存在下でも高い抗ウイルス活性を示すこと，このときPVF-tet処理の場合と同様にHAを蓄積した液胞様構造体が形成されることを見いだした（図2A）．この構造体にはABCA3が存在するが，ラメラボディーとは異なり，Lysotackerで強染色され，またコレステロールの蓄積も顕著であった．以上の結果は，HAを蓄積・隔離することで抗IAV活性を示す液胞様構造体は，細胞が本来有している生体防御機構であり，PVF-tet処理やABCA3の高発現の条件下でIAV感染により形成誘導される新たなオルガネラである可能性を示している．

図2 抗IAV活性を示す液胞様構造体の形成にはオートファジー経路が関与する

4. 抗IAV活性を示す新規オルガネラの形成にはオートファジー経路が関与する

PVF-tet処理やABCA3の高発現下でIAV感染により誘導される，本抗ウイルスオルガネラの形成機構を解明するため，透過型電子顕微鏡による微細形態観察を行った．その結果，いずれの場合にもその内腔には高電子密度構造体とともに，ラメラ様の膜構造体が含まれていることを見いだした（図2B）．このような形態的性状は，後期エンドソームとオートファゴソームの融合により生じる既知のオルガネラ「アンフィソーム」の性状と非常によく一致する7）．そこで，本オルガネラ形成におけるオートファジー経路の関与を検討した．まず，PVF-tet処理やABCA3高発現下で誘導されるオルガネラには，オートファゴソーム膜のマーカーであるLC3が局在していることを見いだした．そこで，オートファゴソーム形成に必須の役割を果たしているクラスIII PI3K，ならびにその上流分子であるULK1を欠損したMDCK細胞由来細胞株を樹立し，本オルガネラの形成ならびに抗ウイルス活性を検討した．その結果，いずれの場合にも本オルガネラの形成が起こらず，また抗ウイルス活性も消失することが示された（図2C）．このことから，本オルガネラは，IAV感染時にPVF-tet処理やABCA3高発現下で形成誘導され，その形成にはオートファゴソームの形成が密接に関与する，誘導性アンフィソームである，ということができる（図3）．

図3 抗ウイルス活性を示す誘導性アンフィソームの形成モデル

5. IAV感染におけるオートファジー機構の多面性

これまで，IAV感染によって誘導されるオートファジーは，感染に促進的であるとする報告が主流であった8）．たとえば，IAV感染によってLC3-IIが蓄積し，オートファゴソーム形成が誘導されること，PI3Kの阻害剤はこれらの現象を妨げ，ウイルスの増殖に対して抑制的に働くことが報告されている9）．さらに，IAVの構造タンパク質であるM2は，そのプロトンチャネル活性によりオートファゴソームからオートリソソームへの成熟を阻害し，未成熟なオートファゴソームを蓄積させること，その後M2上に存在するLC3と相互作用するモチーフ（LC3-interacting region：LIR）を介して，蓄積したオートファゴソームを細胞膜へとリクルートし，IAV粒子形成に必要な膜の供給源として利用していること，が報告されている10, 11）．さらに最近，IAVの感染に伴ってオートファゴソームにウイルスmRNAとリボソーム複合体がリクルートされること，すなわちオートファゴソームがIAVタンパク質合成の場として機能する可能性が示されている12）．これに対し，PVF-tet処理やABCA3高発現下で形成誘導され，強い抗ウイルス活性を示す誘導性アンフィソームの存在は，オートファジー機構が感染に防御的に働く場合があることを明瞭に示している．これまでの報告と一致して，PVF-tet未処理の場合でも感染によりLC3-II陽性のオートファゴソームは形成されるが，ここには新生HAはまったく局在しない．一方，抗ウイルス活性を示すLC3-II陽性の誘導性アンフィソーム内には大量の新生HAが分解されることなく蓄積・隔離されているが，M2を含む他のウイルスタンパク質は存在しない．このことから，PVF-tetは抗ウイルス活性を示す誘導性アンフィソームの形成を促進するだけでなく，感染によって誘導されIAV増殖に促進的に働くオートファゴソーム形成を抑制することによっても，抗IAV活性を発揮していると考えられる．

6. おわりに

近年，ペルオキシソームやミトコンドリアがウイルスに対する免疫応答の起点として機能する例や13, 14），エンテロウイルスが小胞体・ゴルジ体を複製オルガネラへと変容させることで自己複製のための場を形成する例など15），オルガネラを場とした宿主–病原微生物の攻防が明らかにされつつある．本稿で紹介した，抗IAV活性を示すオルガネラとしての誘導性アンフィソームは，その新たな例として位置づけられる．今後はその形成機構の詳細について，分子レベルで解明してゆく必要がある．すでに，PVF-tet処理ならびにABCA3高発現下で形成誘導される誘導性アンフィソームを，それぞれ単離する系を確立しており，その構成脂質ならびにタンパク質について網羅的な解析が進行中であり，新たな創薬標的の同定等へと発展することが期待できる．

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近江 純平（おうみ じゅんぺい）

東京大学大学院薬学系研究科衛生化学教室特任助教．博士（理学）．

略歴 ◇ 2019年同志社大学大学院生命医科学研究科博士後期課程修了．19～20年東北大学大学院薬学系研究科分子細胞生化学分野特任助教．20年5月より現職．

研究テーマと抱負 ◇ 免疫システムにおけるリン脂質・リゾリン脂質の未知機能を探る．予想外の現象に遭遇した時こそ，ユニークな発見のチャンスと捉えて全力で取り組みたい．

ウェブサイト ◇ https://sites.google.com/view/eiseikagaku-jp/home

趣味 ◇ お笑い鑑賞（吉本新喜劇など）．

西川 喜代孝（にしかわ きよたか）

同志社大学生命医科学部教授．薬学博士．

略歴 ◇ 1989年東京大学大学院薬学系研究科博士課程修了．89～97年慶應義塾大学医学部薬理学教室助手．95～98年Harvard Medical School, Dr. L. C. Cantleyポスドク．98～2006年国立国際医療センター研究所室長．07年より現職．

研究テーマと抱負 ◇ 細菌毒素・ウイルスタンパク，各種疾患関連分子を標的とした創薬研究．オリジナルな制御分子（主にペプチド）を同定し，その分子を使ったからこそ見えてくる生命現象に魅力を感じる．

ウェブサイト ◇ http://medsystems.doshisha.ac.jp/labo_base_1/p1/

趣味 ◇ 犬の散歩中の瞑想．