みにれびゅう

セレノプロテインPの翻訳を抑制する新規noncoding RNAの同定およびその病態生理学的意義

三田 雄一郎¹⁾・斎藤 芳郎²⁾

¹⁾ 同志社大学生命医科学部医生命システム学科システム生命科学研究室 ◇ 〒610–0394　京都府京田辺市多々羅都谷1–3

²⁾ 東北大学大学院薬学研究科代謝制御薬学分野 ◇ 〒980–8578　宮城県仙台市青葉区荒巻字青葉6–3 C301

1. はじめに

血漿中に存在するセレノプロテインP（SELENOP）は，必須微量元素セレン（Se）を含むタンパク質であり，Seをセレノシステイン（Sec；システインの硫黄がSeに置き換わったアミノ酸）の形で持つ．SELENOPは，Seを全身に運ぶ役割を担っている．近年，血中SELENOPの増加が，2型糖尿病を増悪させることが明らかになり，糖尿病治療標的として注目されている1, 2）．SELENOPをはじめとするSe含有タンパク質は，ユニークな翻訳機構により合成される．Se含有タンパク質をコードするmRNAの3′非翻訳領域（3′UTR）には，Sec挿入配列（SECIS）と呼ばれる安定なループ構造を持つ配列が存在し，通常では終止コドンとして認識されるUGAにSecが挿入される．SECISには，UGAのアンチコドンを持つSec-tRNASecや特異的な伸長因子eEFSec, SECIS結合タンパク質SBP2が複合体を形成している．Se含有タンパク質の翻訳においてポリペプチドがUGAまで合成されると，複合体からSecが供給され，UGA以外の終止コドンで翻訳が止まる．

我々は，SECIS配列を解析する過程で，SELENOP mRNAのSECISを含む3′UTRと相補的な配列を持つ機能不明の遺伝子coiled coil domain-containing protein 152（CCDC152）を同定した．SELENOPを発現しているヒト肝がん由来HepG2細胞にCCDC152を過剰発現させたところ，SELENOP mRNA量を変化させることなく，タンパク質量を減少させた．CCDC152 RNAは核内に多く存在すること，CCDC152を発現していないHEK293細胞に過剰発現させてもタンパク質を検出できないこと，CCDC152 RNAとSELENOP mRNAが結合することなどから，RNAとして機能する可能性が考えられた．CCDC152を過剰発現させたHepG2細胞では，SELENOP mRNAとリボソームの結合や，SECIS結合タンパク質SBP2の結合が減少した．我々はこれらの機能からCCDC152をlong noncoding RNA inhibitor of selenoprotein P translation（L-IST）と命名した3）．L-ISTを増加させる化合物として，緑茶の主成分として知られるエピガロカテキンガレート（EGCg）を同定し，EGCgがマウス肝臓のL-IST増加および血中SELENOP量の減少を引き起こすことを見いだした．SELENOPの発現増加が2型糖尿病の発症進展に関わることから，L-ISTの増加は，糖尿病の予防と治療に有効となる可能性がある．以上，本稿ではSe含有タンパク質の翻訳機構について解説し，我々が見いだしたL-ISTの作用を解説する．また，2型糖尿病の新たな治療戦略となるL-ISTの増加について記す．

2. セレノシステインの翻訳機構

必須微量元素であるSeは欠乏すると重篤な心筋症を生じることやがんの発症率が増加することが知られる4, 5）．Seの生理機能を担うタンパク質は，SeをSecの形で含み，ヒトゲノム中には25種類見つかっている．その中には，glutathione peroxidase（GPx）やthioredoxin reductase（TrxR）などの抗酸化タンパク質，iodothyronine deiodinase（IDO）などの甲状腺ホルモン合成に関連するタンパク質が含まれ，酸化ストレス防御やエネルギー代謝に重要な役割を担う．Secのタンパク質中への挿入は翻訳段階で行われており，Secは“翻訳されうる21番目のアミノ酸”とも呼ばれる6）．Secの翻訳に必須なSECISと呼ばれるヘアピン構造にSBP2やSec-tRNASecが結合し，通常は終止コドンとして機能しているUGAコドンにSecが挿入される7）．SECISとSBP2の結合力の強さはSECISの立体構造に依存している．25種類存在するSe含有タンパク質のSECIS塩基配列は，2個のステムループを含むヘアピン構造をとること以外，共通性はほとんど存在しない．そのため，SECISによるSec挿入効率，つまりSe含有タンパク質の翻訳効率はSECISの配列依存的ではなく，SECISの立体構造依存的であることが示唆されている8）．それを裏づけるように，それぞれのSECISとSBP2の結合力には違いがあることが報告されており，SECISの立体構造を変化させる因子はSe含有タンパク質の量を決める因子となりうると考えられる7）．

3. CCDC152の同定と機能解析

SelenoDB（http://selenodb.crg.eu）にあるSECIS配列のBLAST解析を行った結果，Se運搬タンパク質であるSELENOPのSECIS配列に対してアンチセンス配列を持つ遺伝子CCDC152が見つかった（図1A）．CCDC152は，SELENOPの一部coding領域およびSECIS配列を含む3′UTR領域に対するアンチセンス配列を含み，両者は一部完全に相補的な配列を有していた．各種培養細胞におけるCCDC152発現量を解析したところ，ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞やグリオーマU087MG，ヒトTリンパ球腫Jurkat細胞で発現が認められたが，SELENOPを発現分泌する肝がん由来HepG2細胞での発現はわずかであった．マウスの各組織における発現量を比較したところ，SELENOPは主に肝臓，小腸，腎臓で発現がみられるのに対し，CCDC152は精巣で最も発現が高く，肝臓や腎臓，白色脂肪組織でも発現が認められた（図1B）．高脂肪高スクロース食（HFHS）で飼育した糖尿病モデルマウスでは，肝臓におけるSELENOP発現の増加がみられるが，肝臓のCCDC152は低下する傾向が認められた．これらの結果から，CCDC152遺伝子が糖代謝とも関連する可能性が考えられた．

図1 CCDC152遺伝子の模式図と発現（文献3より一部転載）

機能未知であったCCDC152について，SELENOPを発現しているHepG2細胞に過剰発現させ，SELENOP発現に及ぼす効果を検討した．その結果，SELENOPのタンパク質量の減少が起こったが，SELENOP mRNA量に変化は認められなかった（図2A）．SELENOPを発現していないHEK293細胞にCCDC152とSELENOP mRNAを過剰発現した際にも，HepG2細胞と同様に，mRNA量の減少を伴わずにSELENOPタンパク質の減少が起こり，細胞特異性はみられなかった．その他，SELENOP以外のSe含有タンパク質（GPxやTrxR）のタンパク質量，mRNA量には変化がみられず，CCDC152はSe含有タンパク質のSECIS全般に影響を与えるわけではなく，特異的にSELENOPタンパク質量を減少させていると考えられた．また，プロテアーゼ阻害剤を用いた検討からCCDC152はSELENOPの分解を促進していないことから，転写以降の段階でSELENOPタンパク質を減少させている可能性が考えられた．

図2 CCDC152はlong noncoding RNAの特徴を持ち，SELENOPの翻訳段階を阻害する（文献3より一部転載）

次に，CCDC152遺伝子の特徴について解析を行った結果，CCDC152はpoly-A tail構造を持つこと，細胞内の局在は主に核内であることがわかった（図2B）．CCDC152にはオープンリーディングフレーム（ORF）が存在するが，CCDC152を発現していないHEK293細胞に，ORFのC末端にHA-TagをつけたCCDC152を遺伝子導入してもタンパク質が検出されなかった．CCDC152の機能領域について，想定される開始メチオニンが削除される5′末端から500塩基まで欠損（5′Δ500）させてもSELENOPタンパク質の低下作用は維持されたが，600塩基まで欠損（5′Δ600）させると作用が消失した（図2C）．以上のことから，CCDC152がlong noncoding RNAとして機能する可能性が考えられた．

CCDC152が転写以降の段階でSELENOPタンパク質を減少させている可能性が示されたため，SELENOP mRNAとリボソームの結合についてポリソーム解析で評価を行った．その結果，CCDC152を過剰発現したHepG2細胞では，リボソームが豊富に結合している領域（フラクション番号の大きい方）のSELENOP mRNAが有意に減少した（図2D）．一方で，Se含有タンパク質であるGPx4は，CCDC152の過剰発現を行ってもmRNAの分布に大きな変化は認められなかった（データは示さず）．このことから，CCDC152はSELENOPの翻訳段階，特にリボソームとの結合を阻害していることが示唆された．SECISを介したSec挿入に必須の因子であるSBP2とSELENOP mRNAとの結合を確認したところ，CCDC152の過剰発現によってSELENOP mRNAとSBP2との結合が減弱した（図2E）．以上より，CCDC152はSELENOPの翻訳段階，特にSECISとSBP2との結合を阻害していると考えられる．我々は以上の機能からCCDC152をlong noncoding RNA inhibitor of selenoprotein P translation（L-IST）9）と命名した（図3）．

図3 エピガロカテキンガレート（EGCg）によるL-IST（CCDC152）増加を介したSELENOP低下作用（文献3より一部転載）

4. EGCgはL-ISTの発現を増加させ，SELENOPタンパク質を減少させる

血中SELENOPの増加は，糖尿病7, 8）・肺高血圧9）を増悪させることがすでに明らかにされており，SELENOPを低下させる方法の確立は，関連疾患の新たな治療戦略となる．そこで，L-ISTを増加させる物質の探索を行った．その結果，緑茶の主成分であり糖尿病予防効果が知られているEGCgが，SELENOP mRNA量を変化させることなく，L-ISTを増加させることが明らかになった．EGCgで刺激したHepG2細胞では，L-ISTの増加に伴いSELENOPタンパク質の減少も確認された．そこで，マウスにEGCgを投与する実験を行った結果，EGCg投与マウスの肝臓では，L-ISTの増加が起こり，血中SELENOPの減少がみられた（図3）．

5. noncoding RNAによる翻訳制御メカニズム

ゲノムの中に存在する遺伝子間領域の多くは，機能を持たない“ジャンク領域”と考えられた時期があったが，近年そのジャンク領域から多くのnoncoding RNAが見いだされ，その機能が明らかになっている．タンパク質の「量」の調整に関与するnoncoding RNAの解析は精力的に行われており，siRNAによるRNA干渉は2006年にノーベル医学・生理学賞の受賞対象となった．siRNA/miRNAのような20 mer前後の短いRNAによるタンパク質の減少は，RISC複合体を介し，mRNAの分解などを介してタンパク質を減少させる．それに対し，long noncoding RNAによる翻訳制御メカニズムは，RNAの種類によって異なるメカニズムが報告されている．アンチセンスBASE-1はmRNAの安定化を引き起こすことでBASE-1タンパク質量を増加させる10）．SINEB2配列を持つRNAはリボソームをリクルートすることで，ターゲットとなるmRNAの翻訳を促進する11）．mRNAに直接作用しないlong noncoding RNAとして，competing endogenous RNA（ceRNA）と呼ばれるRNA群が存在する．ceRNAはmiRNAをトラップすることによってmiRNAの作用を弱め，標的になっているmRNAのコードするタンパク質量を増加させる12）．今回同定されたL-ISTは，SELENOP mRNAのSECIS配列の相補的な配列を有し，SELENOP mRNAと直接結合することによって，SICISとSBP2との結合を阻害し，SELENOP mRNAとリボソームの結合を阻害すると思われる．SECISの立体構造と翻訳効率との関連性は研究が進んでいるが，立体構造に影響を与える因子の探索は進んでおらず，L-ISTの発見は新たな視点を提供すると考えられる．

6. おわりに

我々は，SELENOP mRNAの持つSECIS配列と相補的な配列を持つ新規noncoding RNA, L-ISTを同定した．L-ISTはSELENOPの翻訳段階を特異的に阻害することによって，SELENOPタンパク質量を減少させた（図3）．SELENOPはもともとSe運搬タンパク質として研究が進められてきたが，近年の研究で過剰なSELENOPが糖尿病をはじめとした多くの疾患に関連することが明らかとなってきている1, 2, 9）．L-ISTはSELENOPのタンパク質量を特異的に下げることができるため，L-ISTを増加させる治療法の確立は，SELENOP高値の患者に対する個別化医療として有効であると考えられる．

謝辞

本稿で紹介したCCDC152/L-ISTに関する研究は，野口範子　同志社大学教授，稲田利文　東京大学教授の協力のもと行いました．この場を借りて感謝申し上げます．

1) Mita, Y., Nakayama, K., Inari, S., Nishito, Y., Yoshioka, Y., Sakai, N., Sotani, K., Nagamura, T., Kuzuhara, Y., Inagaki, K., et al. (2017) Selenoprotein P-neutralizing antibodies improve insulin secretion and glucose sensitivity in type 2 diabetes mouse models. Nat. Commun., 8, 1658.

2) Misu, H., Takamura, T., Takayama, H., Hayashi, H., Matsuzawa-Nagata, N., Kurita, S., Ishikura, K., Ando, H., Takeshita, Y., Ota, T., et al. (2010) A liver-derived secretory protein, selenoprotein P, causes insulin resistance. Cell Metab., 12, 483–495.

3) Mita, Y., Uchida, R., Yasuhara, S., Kishi, K., Hoshi, T., Matsuo, Y., Yokooji, T., Shirakawa, Y., Toyama, T., Urano, Y., et al. (2021) Identification of a novel endogenous long non-coding RNA that inhibits selenoprotein P translation. Nucleic Acids Res., 49, 6893–6907.

4) Duntas, L.H. & Benvenga, S. (2015) Selenium: an element for life. Endocrine, 48, 756–775.

5) Rayman, M.P. (2012) Selenium and human health. Lancet, 379, 1256–1268.

6) Vindry, C., Ohlmann, T., & Chavatte, L. (2018) Translation regulation of mammalian selenoproteins. Biochim. Biophys. Acta, Gen. Subj., 1862, 2480–2492.

7) Low, S.C., Grundner-Culemann, E., Harney, J.W., & Berry, M.J. (2000) SECIS-SBP2 interactions dictate selenocysteine incorporation efficiency and selenoprotein hierarchy. EMBO J., 19, 6882–6890.

8) Donovan, J. & Copeland, P.R. (2012) Selenocysteine insertion sequence binding protein 2L is implicated as a novel post-transcriptional regulator of selenoprotein expression. PLoS One, 7, e35581.

9) Kikuchi, N., Satoh, K., Kurosawa, R., Yaoita, N., Elias-Al-Mamun, M., Siddique, M.A.H., Omura, J., Satoh, T., Nogi, M., Sunamura, S., et al. (2018) Selenoprotein P promotes the development of pulmonary arterial hypertension. Circulation, 138, 600–623.

10) Faghihi, M., Modarresi, F., Khalil, A., Wood, D.E., Sahagan, B.G., Morgan, T.E., Finch, C.E., St Laurent, G. 3rd, Kenny, P.J., & Wahlestedt, C. (2008) Expression of a noncoding RNA is elevated in Alzheimer’s disease and drives rapid feed-forward regulation of beta-secretase. Nat. Med., 14, 723–730.

11) Carrieri, C., Cimatti, L., Biagioli, M., Beugnet, A., Zucchelli, S., Fedele, S., Pesce, E., Ferrer, I., Collavin, L., Santoro, C., et al. (2012) Long non-coding antisense RNA controls Uchl1 translation through an embedded SINEB2 repeat. Nature, 491, 454–457.

12) Tay, Y., Kats, L., Salmena, L., Weiss, D., Tan, S.M., Ala, U., Karreth, F., Poliseno, L., Provero, P., Di Cunto, F., et al. (2011) Coding-independent regulation of the tumor suppressor PTEN by competing endogenous mRNAs. Cell, 147, 344–357.

三田 雄一郎（みた ゆういちろう）

同志社大学生命医科学部医生命システム学科助教．博士（医学）．

略歴 ◇ 2003年群馬大学工学部卒業，05年京都府立大学大学院農学研究科博士前期課程修了，10年岡山大学大学院医歯薬学総合研究科博士課程修了．京都府立医科大学博士研究員，同志社大学特別研究員，宮崎大学特任助教を経て18年より現職．

研究テーマと抱負 ◇ noncoding RNAによるSe代謝制御メカニズムの解析．Se含有タンパク質は生命維持に必須のタンパク質だが，その翻訳調整メカニズムは詳しくわかっておらず，その解明を目指している．

ウェブサイト ◇ https://systemlifescience.wixsite.com/system-life-science/welcome-message

趣味 ◇ サイクリング．

斎藤 芳郎（さいとう よしろう）

東北大学大学院薬学研究科教授．博士（薬学）．

略歴 ◇ 1996年北海道大学薬学部卒業，2001年同大学院薬学研究科博士課程修了．2000年よりJSPS特別研究員DC2，02年産業技術総合研究所研究員，08年同志社大学生命医科学部講師，12年同大准教授，18年同大教授．18年9月より現職．

研究テーマと抱負 ◇ セレンや超硫黄分子など微量元素や活性種の代謝を分子レベルで理解し，その生理的意義を明らかにするとともに，関連する疾患の治療に役立てることを目指しています．生体内の絶妙なバランスを分子レベルで明らかにしていきたい．

ウェブサイト ◇ http://www.pharm.tohoku.ac.jp/~taisya/index.html

趣味 ◇ スポーツ観戦，日本酒とコーヒー．