みにれびゅう

酸化ストレスに応答したリソソームの細胞内局在制御機構の解明

笹澤 有紀子¹,2)・斉木 臣二²,3)

¹⁾ 順天堂大学大学院医学研究科老人性疾患病態・治療研究センター ◇ 〒113–8421　東京都文京区本郷2–1–1

²⁾ 順天堂大学大学院医学研究科神経学講座 ◇ 〒113–8421　東京都文京区本郷2–1–1

³⁾ 筑波大学医学医療系神経内科学分野 ◇ 〒305–8576　茨城県つくば市天久保2–1–1

1. はじめに

リソソームは60種以上のさまざまな加水分解酵素を含む細胞小器官（オルガネラ）で，タンパク質や核酸，脂質などさまざまな生体高分子の分解を担う．長い間リソソームは細胞内成分を消化するためのオルガネラという限定的な認識をされていたが，近年それ自体がさまざまな生理機能に関与するという報告がなされつつある．そのようなリソソームのさまざまな機能獲得が可能となるのはリソソームの細胞内での分布が厳密に制御されていることに起因する．

リソソームは微小管上をモータータンパク質の働きによって輸送され，ダイニンモータータンパク質の働きにより微小管形成中心（microtubule organizing center：MTOC）へ，キネシンモータータンパク質の働きにより細胞辺縁部に輸送される．細胞辺縁部に存在するリソソームはlysosomal exocytosisに寄与し，Cathepsinやmatrix metalloproteinase（MMP）などを放出させることでがんの転移に関与する1, 2）．一方，MTOC周辺に集積したリソソームは，オートファゴソームとの会合機会の増加によりオートファジーの促進に寄与する3, 4）．実際，オートファジーを誘導する飢餓条件では，リソソームがMTOC周辺に集積する．

筆者らは最近パーキンソン病患者血清中で酸化ストレスを誘導するアルデヒドが増加すること，またそれに応答してリソソームがMTOCに集積することを見いだした5）．本稿では，酸化ストレスと神経変性疾患との関連についてまとめ，酸化ストレス誘導性のリソソーム逆行輸送のメカニズムとその意義について解説したい．

2. 酸化ストレスとパーキンソン病

酸化ストレスとは，「酸化反応により引き起こされる生体にとって有害な作用」のことで，活性酸素種（reactive oxygen species：ROS），フリーラジカルの酸化損傷力と抗酸化物質や抗酸化酵素による抗酸化力との差として定義される．多くの疾患病態と酸化ストレスとの関連が示唆されているが，その一つがパーキンソン病（Parkinson’s disease：PD）である．

PDは中脳黒質のドパミン神経細胞の障害による運動機能低下を主症状とする神経変性疾患である．PDのほとんどが孤発性であるが，遺伝型PDの疾患関連遺伝子・責任遺伝子機能の研究によりその病態がわかりつつある．責任遺伝子として同定されたPINK1，PARKIN，DJ-1，LRRK2の変異は，ミトコンドリア異常を誘発し酸化ストレスを引き起こす．さらに，神経伝達物質として働くドパミンは，その代謝過程で酸化ストレスを誘導する反応性の高い副生成物を産生するため，中脳ドパミン神経細胞はダメージを受けやすくなる6）．また，PDの最大の特徴であるα-synucleinのオリゴマーは金属イオンと反応し，ROSを発生させる7）．このように，PDの病態において酸化ストレスが中心的な役割を果たしていることが示唆されている．

筆者らは，パーキンソン病患者血清を用いたメタボローム解析（代謝物の網羅的解析）を行い，ポリアミン代謝が変動することを見いだした8）．さらにこの代謝過程で生じるアクロレインがPD患者血清中で増加していることを示した9）．アクロレインはタバコの煙，排気ガスなどに含まれ，有機物の燃焼時にも発生する最小のα, β-不飽和アルデヒドで，非常に反応性が高く，細胞内の求核性分子と反応し，細胞にダメージを与える毒性物質である．これまで酸化ストレスの主要因はROSと考えられていたが，アクロレインはそれよりも毒性が強く酸化ストレスを誘導するとされる9）．

3. 酸化ストレスに応答したリソソーム分布制御

このように，PD血清中でアクロレインが増加していることが明らかになったわけだが，実際にアクロレインにさらされた細胞はどのような応答を示すか，その詳細は明らかになっていない．そこで筆者らは，ヒト神経芽腫SH-SY5Y細胞を用いてその細胞応答を解析した．そこで明らかになったのが，冒頭に述べた「リソソーム集積」活性である．

1）リソソーム逆行輸送経路の同定

前述のとおり，リソソームの細胞内分布が細胞応答に重要な役割を果たすことが明らかになるにつれ，ここ10年ほどの間にリソソームの逆行輸送に関するシグナルが急速に解明されてきている．リソソーム膜（または膜結合）タンパク質がアダプタータンパク質を介しモータータンパク質ダイニン／ダイナクチンに結合するが，これらのタンパク質の組合わせは大きく三つに大別される．1）リソソーム膜Ca2＋チャネルTRPML1とALG2を介する経路10），2）リソソーム膜タンパク質TMEM55bとJIP4を介する経路11），3）GTPaseであるRab7とRILPを介する経路12）である．さらに昨年，酸化ストレス誘導性のSept913），飢餓ストレス応答性のRUFY3/4–JIP4–Arl8を介するリソソーム逆行輸送経路14）が報告されている（図1）．

図1 主なリソソーム逆行輸送に関わるタンパク質

筆者らは，アクロレイン誘導性のリソソーム輸送経路がどのシグナルを介するかを調べるためにノックダウン実験を施行し，アクロレインはTRPML1/ALG2を介した経路でリソソーム集積を誘導することを示唆した．さらに，JIP4もアクロレイン誘導性のリソソーム輸送に必須因子であったが，JIP4の結合相手とされるTMEM55B11）は不思議なことに，関与しなかった．このことは，JIP4がTMEM55B以外の分子と結合し，新規機構でリソソーム輸送を制御することを示している．我々は，この未知の結合パートナーはTRPML1およびALG2ではないかと仮説を立てた．

実際，近接ライゲーションアッセイを行うと，アクロレイン処理時にJIP4とALG2の相互作用が確認された．一方で，一般的な免疫沈降法ではTRPML1, ALG2の結合は確認できたが，JIP4とALG2の結合は確認できなかったことから，JIP4とALG2の結合が弱いか，他の分子を介して相互作用していることが示唆された．ではなぜJIP4はTMEM55BではなくTRPML1/ALG2と相互作用できるようになったのだろうか？

2） キナーゼ阻害活性プロファイル法を用いたJIP4のキナーゼ同定

我々はアクロレインがJIP4の翻訳後修飾を促し，性質を変化させている可能性を考慮し，Phostag-PAGEを実施しJIP4のリン酸化を評価した．その結果，予想どおりアクロレインの添加によりJIP4はリン酸化された．では，このJIP4のリン酸化がリソソーム集積のキープレーヤーなのだろうか．それを明らかにするためにはキナーゼを同定する必要がある．そこで我々は，キナーゼ阻害剤ライブラリーを用いて，リソソーム集積を阻害する阻害剤を同定することで，キナーゼ同定を試みた．ここで考案したのが「キナーゼ阻害剤の活性プロファイルを用いたキナーゼ同定法」である．

キナーゼ阻害剤は標的キナーゼの活性のみを特異的に阻害するものは少なく，ほとんどの阻害剤が非特異的な活性を示す．それは，保存性の高いATP結合部位とその周辺をターゲットとするものが多いことに起因する．つまり，リソソーム集積を阻害する阻害剤がヒットしたからといって，必ずしもデータシート上の標的キナーゼが直接関与するわけではないのである．そこで我々はキナーゼ阻害剤の「特異性のなさ」を逆手にとった．それを可能にしたのは2011年に報告されたキナーゼ阻害剤のキナーゼ阻害活性プロファイル15）である．この論文では，178種の市販キナーゼ阻害剤の300種のキナーゼに対するin vitroにおける阻害活性をプロファイルしたものである．このデータベース15）を用いて，スクリーニングに用いたキナーゼ阻害剤の300種のキナーゼに対する阻害活性データを抽出する．そして，目的の現象（今回でいえば，アクロレインによるリソソーム集積）を阻害するキナーゼ阻害剤（A群）と目的の現象に影響を与えなかった阻害剤（B群）の2群に分け，A群でのみ活性が阻害され，B群で活性が阻害されないキナーゼを探索する．このキナーゼこそが，目的の現象に関わるキナーゼなのである（図2）．筆者らは，この方法を用いて，キナーゼ阻害剤77種を用い，アクロレインによるリソソーム集積を阻害するものをスクリーニングしたところ，Jak3 inhibitor VI, Gö6976を見いだした．これらの阻害剤のターゲットであるJak3, PKCはリソソーム集積に関与しなかったため，上述の方法を用いて，ヒットした二つのキナーゼ阻害剤でのみ阻害されるキナーゼを探索した結果，JIP4の新規キナーゼとして，Ca2＋／カルモジュリン依存性キナーゼの一つであるCaMK2Gを見いだすことに成功した．実際，CaMK2Gのノックダウンでアクロレインによるリソソーム集積，JIP4のリン酸化は抑制された．さらに，in vitroキナーゼアッセイにより，CaMK2Gが直接JIP4をリン酸化していること，Jak3 inhibitor VIはそれを抑制することが確かめられた．

図2 キナーゼ阻害剤の活性プロファイルを用いたキナーゼ同定法

もちろん，文献15）で示されている活性阻害プロファイルは，ある一律濃度の阻害剤のin vitroの阻害活性プロファイルであるため，すべて細胞内で結果を反映できるわけではなく例外は考慮しなければならないが，十分に参考にできるだろう．

3）リン酸化JIP4を介したリソソーム分布制御機構

CaMK2GはCa2＋に応答するキナーゼである．では，それを活性化させたものは一体何か？　ここで思い出したいのが，JIP4にはTRPML1/ALG2という新しいパートナーが存在する点である．TRPML1は酸化ストレス応答性のリソソーム膜上のCa2＋チャネルである．つまり，活性化されたTRPML1からのCa2＋放出がCaMK2Gを活性化させJIP4リン酸化を誘導し，リン酸化したJIP4がTRPML1/ALG2とともにリソソーム逆行輸送に寄与するという一連のシステムが存在することが示された（図3）5）．実際に過酸化水素水の添加でも同様の経路によりリソソーム集積が誘導されたことから，同定したリン酸化JIP4を介したリソソーム集積は酸化ストレス応答の一つであることが示された．

図3 アクロレインによるリソソーム逆行輸送シグナル

4）酸化ストレス誘導性のリソソーム集積の生理的意義

では，酸化ストレスにおけるリソソーム集積は細胞にとってどのような意義があるだろうか．リソソーム集積が誘導されないJIP4ノックアウト細胞を用いた解析により，アクロレインは，リソソーム集積を介してオートファジーを誘導することが示された．さらに，JIP4ノックアウト細胞はアクロレインの毒性に対し脆弱性を示した．以上より，アクロレインが誘導するリソソーム集積は，オートファジー誘導を介した酸化ストレスに対する細胞の防御応答であることが示された．

4. おわりに

本稿では，PD患者血清中で増加するアクロレインに対する細胞の防御応答として，リソソーム集積が起こること，さらにその新規メカニズムとしてリン酸化JIP4を介した逆行輸送経路について示した5）．リソソームの逆行輸送をつかさどるシグナルはここ10年で解明されつつある．実際，飢餓状態におけるリソソーム逆行輸送シグナルについてはTRPML1-ALG2，TMEM55B-JIP4の他，最近だとJIP4-RUFY3/4-Arl8なども見つかっている．しかし，いずれの報告でも，経路の因子をノックダウンすると飢餓によるリソソーム集積が起こらないことを示している．つまり，「どの経路も，どの因子もリソソーム逆行輸送に重要である」ことが示唆されるわけであるが，それぞれのシグナルがどのようにクロストークしているのか，または協同して働いているのか，などまだ残された疑問は多い．リソソームの細胞内分布制御の破綻は，特に神経系の病気の発症に関与することから，互いに影響し，複雑に絡み合っていると予想されるリソソーム逆行輸送機構の全貌の解明が望まれる．

1) Marchesin, V., Castro-Castro, A., Lodillinsky, C., Castagnino, A., Cyrta, J., Bonsang-Kitzis, H., Fuhrmann, L., Irondelle, M., Infante, E., Montagnac, G., et al. (2015) ARF6-JIP3/4 regulate endosomal tubules for MT1-MMP exocytosis in cancer invasion. J. Cell Biol., 211, 339–358.

2) Dykes, S.S., Gray, A.L., Coleman, D.T., Saxena, M., Stephens, C.A., Carroll, J.L., Pruitt, K., & Cardelli, J.A. (2016) The Arf-like GTPase Arl8b is essential for three-dimensional invasive growth of prostate cancer in vitro and xenograft formation and growth in vivo. Oncotarget, 7, 31037–31052.

3) Kimura, S., Noda, T., & Yoshimori, T. (2008) Dynein-dependent movement of autophagosomes mediates efficient encounters with lysosomes. Cell Struct. Funct., 33, 109–122.

4) Korolchuk, V.I., Saiki, S., Lichtenberg, M., Siddiqi, F.H., Roberts, E.A., Imarisio, S., Jahreiss, L., Sarkar, S., Futter, M., Menzies, F.M., et al. (2011) Lysosomal positioning coordinates cellular nutrient responses. Nat. Cell Biol., 13, 453–460.

5) Sasazawa, Y., Souma, S., Furuya, N., Miura, Y., Kazuno, S., Kakuta, S., Suzuki, A., Hashimoto, R., Hirawake-Mogi, H., Date, Y., et al. (2022) Oxidative stress-induced phosphorylation of JIP4 regulates lysosomal positioning in coordination with TRPML1 and ALG2. EMBO J., 41, e111476.

6) Burbulla, L.F., Song, P., Mazzulli, J.R., Zampese, E., Wong, Y.C., Jeon, S., Santos, D.P., Blanz, J., Obermaier, C.D., Strojny, C., et al. (2017) Dopamine oxidation mediates mitochondrial and lysosomal dysfunction in Parkinson’s disease. Science, 357, 1255–1261.

7) Deas, E., Cremades, N., Angelova, P.R., Ludtmann, M.H., Yao, Z., Chen, S., Horrocks, M.H., Banushi, B., Little, D., Devine, M.J., et al. (2016) Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson’s disease. Antioxid. Redox Signal., 24, 376–391.

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笹澤 有紀子（ささざわ ゆきこ）

順天堂大学大学院医学研究科老人性疾患病態・治療研究センター 准教授．博士（理学）．

略歴 ◇ 2007年慶應義塾大学理工学部卒業．同大学院にて修士課程，博士課程を修了．12年博士（理学）取得．同大助教を経て，15年より順天堂大学医学研究科に勤務．研究員，特任助教を経て2023年より現職．

研究テーマと抱負 ◇ リソソームの細胞内分布の制御とオートファジーの関連について解析を進めている．神経変性疾患治療薬開発へ応用することを目標とする．

趣味 ◇ 書鑑賞．