生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

細胞膜（形質膜）はさまざまなアゴニストとその特異的受容体との反応の場であり細胞内シグナル伝達の起点となっている．また，種々の物質輸送や細胞接着などに関わる機能性タンパク質を構造的に支持している場でもある．このようにさまざまな機能を担う細胞膜は，その構成成分の分布が一様ではなく構成脂質が異なるいくつもの局所部分が集合，集散しこれら膜タンパク質の機能を調節していると考えられている（図1A

• 図1 細胞膜マイクロドメインの概念とその構成脂質の解析手法

図1 細胞膜マイクロドメインの概念とその構成脂質の解析手法

（A）細胞膜マイクロドメインは動的構造をとり，タンパク質の機能を制御している可能性が示唆されている．（B）細胞膜をコロイダルシリカビーズ法で分離後，界面活性剤不溶性画分を取得しその構成脂質をLC-MSを用いて解析する．（C）細胞全体（WC）と細胞膜画分（SCM）ならびに界面活性剤耐性細胞膜画分（drSCM）に含まれる各マーカータンパク質（レーンあたりタンパク質10 µgをアプライ）をウエスタンブロットで解析した．PPI：ポリホスホイノシチド，その他の略号は本文参照．［（C）はOgiso, H., Taniguchi, M., & Okazaki T. (2015) J. Lipid Res., 56, 1594–1605より改変］

このような細胞膜脂質の変化とそれに伴うマイクロドメイン領域の機能を解析するために，それぞれの脂質分子に特異的に結合する親和性タンパク質に蛍光タンパク質を融合させた分子プローブなどが開発され，それを用いて可視化する手法がとられてきた^4–6)

• 4) Di Paolo, G. & De Camilli, P. (2006) Nature, 443, 651–657.
• 5) Kiyokawa, E., Baba, T., Otsuka, N., Makino, A., Ohno, S., & Kobayashi, T. (2005) J. Biol. Chem., 280, 24072–24084.
• 6) Yachi, R., Uchida, Y., Balakrishna, B.H., Anderluh, G., Kobayashi, T., Taguchi, T., & Arai, H. (2012) Genes Cells, 17, 720–727.

一般的に行われているマイクロドメイン脂質（ラフト脂質）の解析は，主に細胞破砕後，核を除いてから1%Triton X-100等で処理したのち40%以上のスクロース濃度とし密度勾配の最下層に置き，これをスクロース密度勾配超遠心分離することにより浮遊してくる画分を，界面活性剤不溶性の膜脂質画分（ラフト画分）として取得し解析する手法がとられてきた．だがこの方法では細胞膜のみに限定しておらず，細胞内オルガネラ膜すべてにおける界面活性剤不溶性画分が得られるので，多胞体（multivesicular body: MVB）などはこの浮遊画分に回収されるものと推定される．また手法によっては，細胞破砕液から核を除かずに界面活性剤処理するケースも少なからず見受けられ，この場合多くの核脂質成分が浮遊画分に回収されるものと推定される．さらには浮遊画分には多くの界面活性剤が混入しており，質量分析による脂質解析をしばしば妨害する．

金属イオンを結合したコロイド状シリカ（Ludox CL等のカチオニックコロイダルシリカビーズ）を用いた細胞膜分離法は，細胞膜プロテオミクスに応用されている⁸⁾

• 8) Kim, Y., Elschenbroich, S., Sharma, P., Sepiashvili, L., Anthony, O., & Kislinger, T. (2011) Methods Mol. Biol., 748, 227–241.

我々は接着性培養細胞の細胞膜リピドミクスのために方法を最適化した⁷⁾

• 7) Ogiso, H., Taniguchi, M., & Okazaki, T. (2015) J. Lipid Res., 56, 1594–1605.

1. 1）細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回，コーティングバッファー［CB: 20 mM MESバッファー（pH 5.3），150 mM NaCl］で1回洗浄後，1%Ludox CLを含むCB液で10分間処理する．
2. 2）CBで2回洗浄後さらに0.1%ポリアクリル酸を含むCB液で10分間処理して細胞表面に結合したシリカビーズを架橋する．
3. 3）CBで3回洗浄したのち細胞破砕バッファー［20 mM MESバッファー（pH 8.0），1 mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA），1 mg/mLウシ血清アルブミン（BSA），プロテアーゼインヒビターカクテル］1 mLで細胞をかきとる．
4. 4）これを2 mL容ポリプロピレン（PP）製マイクチューブに回収し，18ゲージ針に20回通し細胞を完全に破砕したのちナイロンメッシュ（約80 µm目開き）を通して過剰にゲル化したポリアクリル酸を除く．
5. 5）1000×g，4°Cで20分間遠心後上清を除き，洗浄バッファー［WB: 20 mM MESバッファー（pH 8.0），150 mM NaCl，1 mM EDTA，8 mMジチオトレイトール（DTT），7%スクロース，0.01% Brij 98，プロテアーゼインヒビターカクテル］0.8 mLで沈殿物を懸濁し，27ゲージ針に10回通し均一懸濁液とする（0.01% Brij 98は脂質を可溶化することなく試料の器具内壁への付着による回収ロスを低減するために添加されている）．
6. 6）洗浄後さらにWB 0.4 mLに懸濁し，150 mM NaClを含む50% Nycodenz 0.4 mLと混合したのち27ゲージ針を5回通し均一懸濁液とする．
7. 7）超遠心チューブ内に作製した150 mM NaClを含むNycodenz 70%と50%のステップグラジエントの上にのせ，100,000×g，4°Cで60分間遠心後，チューブ底に形成されたフィルム状沈殿物を最終バッファー（5 mMイミダゾールバッファー，150 mM NaCl，8 mM DTT，7%スクロース，pH 7.0）0.3 mLに懸濁したのち18,000×g，4°Cで20分間遠心し沈殿物としてシリカコート細胞膜（silica-coated membranes: SCM）を回収する．このときSCMがプラスチック器具表面に付着して回収率が下がることを防ぐため，親水性ポリマーコートしたピペットチップ（MPCポリマー処理プラスチック製品など）を使用する．

次にマイクロドメイン脂質を解析するため，SCMに対して界面活性剤処理を行う．ラフト画分を得るために通常用いられる1% Triton X-100のみでは，ホスファチジルセリン（PS）やホスファチジルエタノールアミン（PE）が過剰に可溶化されてしまうため，これを防ぐ目的で1% Brij 98を保護剤として共存させている．

1. 8）上述のSCM 0.3 mL懸濁液を氷冷しながら，終濃度1% Triton X-100，1% Brij 98になるように添加し，27ゲージ針に20回通して均一懸濁液とし氷上で30分処理する．
2. 9）18,000×g，4°Cで20分間遠心し，沈殿物として界面活性剤不溶性SCM（detergent-resistant SCM: drSCM）を回収する．drSCMには界面活性剤に不溶性のマイクロドメイン脂質が保持されている．ただしこのdrSCM画分には，非ラフトタンパク質，ラフトタンパク質に関わらず膜タンパク質の多くはシリカビーズに結合した状態で残存している（図1B
   • 図1 細胞膜マイクロドメインの概念とその構成脂質の解析手法
   ）．

組織から全脂質を効率よく抽出する方法として，Bligh–Dyer法等が広く使われているが，我々は①トリアシルグリセロールなどの高脂溶性脂質は逆相LC-MSにおいてリン脂質測定を妨害するため測定対象としない，②脂質抽出操作には可能な限りポリプロピレン（PP）製ディスポーザブル器具を用いて操作性を高める，③将来的な自動化に対応できる，ということを考慮して脂質抽出法を見直した⁹⁾

• 9) Ogiso, H., Taniguchi, M., Araya, S., Aoki, S., Wardhani, L.O., Yamashita, Y., Ueda, Y., & Okazaki, T. (2014) Metabolites, 4, 98–114.

1. 1）臓器の場合は50 mg湿重量に対し9倍量のPBSを添加しマイクロチューブ内ですりつぶし懸濁液を作製する．
2. 2）このうち10 µL（1 mg湿重量相当）を1.5 mL容マイクロチューブにとる（血清の場合は10 µL，培養細胞の場合は1×10⁶個が必要十分量である）．
3. 3）これにメタノール（MeOH）／ブタノール（BuOH）（1 : 1）混液0.1 mLを添加し攪拌後，超音波洗浄機を用いて超音波処理してすばやく酵素を失活させる．
4. 4）次に各50～5000 pmolを含む内標準混液50 µLを添加する．
5. 5）BuOH 700 µL，水200 µL，0.5Mリン酸バッファー（pH 6.0）50 µLを混合し，5分間攪拌後3分間超音波処理する．
6. 6）4000×g，5分間遠心したのち上層0.7 mLを2 mL容PP製マイクロチューブに採取する．
7. 7）残液に酢酸エチル0.35 mLとヘキサン0.35 mLを添加し5分間攪拌する．
8. 8）遠心後上層0.7 mLをとり最初に採取した抽出液と混合する．
9. 9）この抽出液にさらにMeOH 0.7 mLを混合し均一溶液としたのち，このうち10分の1量（約0.21 mL）を1.5 mL容PP製マイクロチューブに採取し，遠心エバポレーターを用いて約40°Cで溶媒を留去する．
10. 10）残渣に，後述の液体クロマトグラフ（LC）の移動相溶媒B液20 µLを添加して攪拌したのち，同移動相溶媒A液30 µLを混合して4000×g，5分間遠心して上清40 µLを得る⁹⁾
    • 9) Ogiso, H., Taniguchi, M., Araya, S., Aoki, S., Wardhani, L.O., Yamashita, Y., Ueda, Y., & Okazaki, T. (2014) Metabolites, 4, 98–114.
    ．
11. 11）この液を用いて，中性脂質［ジアシルグリセロール（DAG），セラミド（Cer）等］と塩基性脂質［ホスファチジルコリン（PC），スフィンゴミエリン（SM）等］の測定を行う．

微量酸性脂質についてはLC分離後でも，共存する大量の塩基性脂質を原因とするイオンサプレッション等によりその定量値が影響を受けるため，次に述べる酸性脂質分画を行い別に測定する．上述の抽出液の残り10分の9量について以下の操作を行う．

• 12）活性化済みDEAEセルロース樹脂を1 mL用ピペットチップに詰めて，DEAEセルロースカラム（0.5 mLベッド）を作製しておく．
• 13）酢酸1 mL，MeOH 3 mLを順に流してカラムを洗浄後，抽出液をアプライし酸性脂質を結合させる．
• 14）MeOH 2 mLで洗浄後，MeOH/28%アンモニア水／ギ酸（1000 : 33 : 22, v/v）1 mLを流し酸性脂質を溶出させ2 mL容PP製マイクロチューブに回収する．
• 15）遠心エバポレーターを用いて約50°Cで溶媒を留去したのち，残渣に移動相溶媒A液40 µLを添加し攪拌後4000×g，5分間遠心して上清40 µLを得る．
• 16）この液を用いて，酸性脂質［ホスファチジルセリン（PS），ホスファチジルイノシトール（PI），ホスファチジン酸（PA），スフィンゴシン1-リン酸（S1P），ガングリオシドGM3等］の測定を行う．

内標準液には各脂質クラスについて，生体内にほとんど存在しないかまたは含量の小さい化合物を用いる．たとえば，PC（14 : 0/14 : 0），PE（14 : 0/14 : 0），Cer（d18 : 1/12 : 0），S1P（d17 : 1），S1P（d17 : 0），などの市販品を利用する．プラズマローゲンPEについては適当な化合物が市販されていないため，PE（p18 : 0/18 : 1）500 pmolとPE（14 : 0/14 : 0）500 pmolを含む外部標準液を作製し，試料と同時に前処理および測定を行い，PE（p18 : 0/18 : 1）のPE（14 : 0/14 : 0）に対するレスポンスファクターを求め，これをプラズマローゲンPEの補正係数として掛けることにより濃度を算出している．他の脂質に関しても，外部標準液を使って同様にレスポンスファクターを測定することで，より正確な定量値を求めることができる．

我々がLC-MSを用いてリン脂質やジアシルグリセロールを再現性良く高感度に測定する上で留意している一般事項について言及する．S1P，PA等の遊離リン酸基を有する化合物は金属に結合し回収率が低下するため，オートサンプラーのインジェクター部分はイナート（不活性）材質とする，配管はPEEK（ポリエーテルエーテルケトン）製とするなどの注意が必要である^10,11)

• 10) Ogiso, H., Suzuki, T., & Taguchi, R. (2008) Anal. Biochem., 375, 124–131.
• 11) Ogiso, H. & Taguchi, R. (2008) Anal. Chem., 80, 9226–9232.

• 《我々の研究室で使用しているLC-MSシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）》
  • 質量分析器：TSQ-Vantage
  • 液体クロマトグラフ装置：Ultimate3000
  • LCカラム：Acclaim PepMap100（1.0 mm×15 cm）

上述の方法を用いてMEFの細胞膜マイクロドメイン脂質の解析を行った．その結果，細胞全脂質に対する細胞膜（SCM）の比率は約6%程度であった．一般的に，細胞膜脂質が細胞全脂質の10%程度と考えられていること，本方法が培地に接触している細胞膜領域のみを回収する方法であることを考慮すると，合理的な回収率と考えられた．細胞膜（SCM）脂質について，細胞全脂質に比べてPC含有率は下がりCholとSM含有率は上がるものの，特徴的な脂質分子種が濃縮されることはなかった（図2A

• 図2 細胞膜脂質の解析例

図2 細胞膜脂質の解析例

（A）野生型MEFとSM合成酵素欠損MEFとの構成脂質を比較した．（B）界面活性剤耐性領域（ラフト領域）の占める割合を比較した．（C）野生型MEFとSM合成酵素欠損MEFのマイクロドメイン構成脂質を脂肪鎖分子種ごとに比較した．LacCer：ラクトシルセラミド，pPE：プラズマローゲンPE，PG：ホスファチジルグセロール，GM3-X：GM3構造を有するGD1等のガングリオシド，その他の略号は本文参照．（Ogiso, H., Taniguchi, M., & Okazaki T. (2015) J. Lipid Res., 56, 1594–1605より改変）

SM合成酵素欠損MEFはマイクロドメインの主要構成脂質であるSMをほとんど含まない細胞であり，この細胞における細胞膜マイクロドメインがどのような状態に変化しているか調べた．その結果，SMが減少した分をモノヘキソシルセラミド（HexCer），GM3，PC（32 : 0），PC（34 : 1）が補っており，マイクロドメイン領域の割合が低下することはなかった（図2A, C

• 図2 細胞膜脂質の解析例

次に血清飢餓処理したMEFに対する血清添加刺激がマイクロドメイン脂質にどのような変化をもたらすかを解析した．刺激後2分でマイクロドメイン構成脂質のうちPA（34 : 1）レベルが一過性に上昇した（図3A

• 図3 血清刺激後のマイクロドメイン構成脂質の変化

図3 血清刺激後のマイクロドメイン構成脂質の変化

（A）血清刺激によって生ずる野生型MEFのマイクロドメイン脂質の変化を解析した．（B）（A）と同条件でホスホリパーゼD阻害剤を添加したときの変化．（C）（A）と同条件でSM合成酵素欠損MEFでの解析結果．（Ogiso, H., Taniguchi, M., & Okazaki, T. (2015) J. Lipid Res., 56, 1594–1605より改変）

細胞膜の脂質解析は古くから報告されているものの，その値は報告者によって異なっていた．本方法は細胞膜を再現よく分離する操作を含み，最終画分に界面活性剤をほとんど含まないため，これまで以上に正確で精度の高い膜脂質の解析が可能となった．しなしながら本方法はシリカビーズに細胞膜タンパク質を結合させており，この結合が容易に外れないことから，マイクロドメイン（ラフト）と非ラフト領域との間でのタンパク質輸送の解析に応用することはできなかった．今後，タンパク質の解析にも応用できるような方法を開発することが課題である．