生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

我々の脳の中では，神経細胞（ニューロン）どうしがシナプスを介して，複雑かつ巧妙につながり合って，外界からの刺激を受容・処理し，適応している．大脳皮質や網膜などの神経回路は，外界からの感覚入力によって生じた神経活動に応じて再編され，刺激に適応した回路に成熟するという“可塑性（plasticity）”があることが知られている．また，海馬においては，経験による神経活動依存的なシナプス形成が新たな記憶形成の重要な基盤になっていると考えられている．一方，このような神経活動依存的なシナプス形成に異常をきたすと，自閉症や精神発達遅滞などの精神疾患が引き起こされると考えられており，神経活動依存的な回路形成の分子機構の解明は，生物学的にも医学的にも重要な課題である．

近年の研究により，神経活動依存的な回路形成に関与する分子カスケードの上流には，CREB, MEF2やMeCP2などの転写因子が存在することがわかっている^1）

• 1) Nonaka, M., Kim, R., Sharry, S., Matsushima, A., Takemoto-Kimura, S., & Bito, H. (2014) Neurobiol. Learn. Mem., 115, 21–29.

最近，ハーバード大のMichael Greenbergらにより，上記の最初期遺伝子の一つである転写因子Npas4が，大脳皮質や海馬などのニューロンにおいて神経活動依存的なシナプス形成に重要な役割を果たすことが明らかにされた^2）

• 2) Lin, Y., Bloodgood, B.L., Hauser, J.L., Lapan, A.D., Koon, A.C., Kim, T.K., Hu, L.S., Malik, A.N., & Greenberg, M.E. (2008) Nature, 30, 1198–1204.

我々はこれまで，成体でも常時新生されている嗅球の介在ニューロン（olfactory bulb interneuron）の発達機構について研究してきた．そして最近，嗅球介在ニューロンにおいて，匂い刺激に応じて発現量が変化する遺伝子を体系的に探索したところ，匂い刺激によりNpas4遺伝子が速やかに発現誘導され，シナプス形成を促進していることを見いだした^4）

• 4) Yoshihara, S., Takahashi, H., Nishimura, N., Kinoshita, M., Asahina, R., Kitsuki, M., Tatsumi, K., Furukawa-Hibi, Y., Hirai, H., Nagai, T., Yamada, K., & Tsuboi, A. (2014) Cell Reports, 8, 843–857.

Npas4は当初，bHLH（basic helix-loop-helix）とPAS（Per/Arnt/Sim）ドメインを持った脳特異的に発現する転写因子NXFとして，住友化学の大江師久らにより，世界に先駆けて同定された（図1

• 図1 興奮性ニューロンにおける転写因子Npas4の機能

図1 興奮性ニューロンにおける転写因子Npas4の機能

神経活動によって発現が誘導されるNpas4はPASドメインを持つ転写因子であり，下流の遺伝子の発現を制御する．大脳皮質や海馬の興奮性ニューロンにおいては，神経活動によってNpas4の発現が上昇すると，下流ターゲットであるBDNFの発現を誘導することにより，シナプス数の増加を引き起こすことが知られている．

嗅細胞で感知された匂い情報はその軸索を通して，一次投射先である嗅球に伝えられ，処理されている．嗅球における抑制性の介在ニューロンである傍糸球細胞（periglomerular cell）や顆粒細胞（granule cell）は，嗅覚二次ニューロンである僧帽細胞（mitral cell）や房飾細胞（tufted cell）とシナプスを形成し，匂い分子の検出や識別などの情報処理を行っている（図2

• 図2 嗅球介在ニューロン（顆粒細胞）の発達

図2 嗅球介在ニューロン（顆粒細胞）の発達

抑制性の嗅球介在ニューロン（顆粒細胞）は成体になっても脳室周辺で新しく産まれて，嗅球に移動し，既存の神経回路に組み込まれている．

1）神経活動依存的なシナプス形成を制御する転写因子

我々は最初に，匂い刺激による神経活動が嗅球介在ニューロンの樹状突起の発達にどのような影響を及ぼすのかを検討した．マウスの片鼻の鼻孔を閉じて匂い刺激を遮断すると，閉じた側の嗅球において縮退がみられた．これは匂いが遮断された側の嗅球において，介在ニューロンのアポトーシスが亢進されることによると考えられる．次に，匂い刺激を遮断されたマウスにおける嗅球介在ニューロンを可視化するために，緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターを嗅球介在ニューロンの幹細胞に感染させた^9）

• 9) Yoshihara, S., Takahashi, H., Nishimura, N., Naritsuka, H., Shirao, T., Hirai, H., Yoshihara, Y., Mori, K., Stern, P.L., & Tsuboi, A. (2012) J. Neurosci., 32, 2217–2226.

図3 Npas4の嗅球介在ニューロンにおける機能

（A）鼻を閉じて匂い刺激を遮断したマウスの嗅球では，嗅球介在ニューロンでNpas4の発現（白）が顕著に減少した．匂い刺激を加えると対照的に，Npas4の発現が強く誘導された．（B）レンチウイルスによりNpas4を過剰発現させる（GOF：gain of function）と嗅球介在ニューロンの樹状突起のスパイン密度が増加した．Npas4ノックアウトマウス（LOF：loss of function）では対照的に，そのスパイン密度が減少した．

2）Npas4遺伝子の下流で神経活動依存的なシナプス形成を制御する因子

Npas4は転写因子であることから，スパイン形成を制御する下流遺伝子の発現を調節していると推測される．そこで，Npas4が発現制御する下流遺伝子を探索するために，Npas4タンパク質が結合するDNA領域をその抗体を用いて同定するクロマチン免疫沈降シークエンシング（chromatin immunoprecipitation-sequencing：ChIP-Seq）を行った．そして，ChIP-Seqにより得られた候補遺伝子について，野生型とNpas4ノックアウトマウスにおける発現を比較したところ，タンパク質の分解を促進するユビキチンリガーゼの一種であるMdm2（mouse double minute 2）遺伝子の発現が，野生型と比べてNpas4を欠損した嗅球介在ニューロンにおいて増加していることがわかった．さらに，Mdm2がユビキチン化し，分解する標的タンパク質を，iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）というプロテオミクスの手法で探索した．その結果，Npas4ノックアウトマウスの嗅球介在ニューロンでは，Mdm2の増加に応じて，微小管結合タンパク質であるダブルコルチン（Dcx）のユビキチン化と分解が促進されていることが判明した．また，嗅球介在ニューロンにおいて，ダブルコルチン遺伝子のみを過剰発現させると，樹状突起上のスパイン密度が増加することがわかった．以上の結果から，嗅球介在ニューロンでは，Npsa4遺伝子の発現量に応じて，Mdm2によるダブルコルチンのユビキチン化や分解を調節することで，スパイン密度を制御していることが明らかになった（図4

• 図4 Npas4によるスパイン形成の制御機構

匂い刺激が高頻度で与えられ，神経活動が活発になった嗅球介在ニューロンでは，Npas4遺伝子の発現量が増加するのに応じて，樹状突起上のスパイン密度が増加して，より多くのニューロンと接続できるようになると推測される．また，嗅球介在ニューロンでは，匂い刺激に応じて樹状突起上のスパイン密度が制御されることにより，嗅球内の神経回路がより洗練されたものに改編されていると考えられる．実際に，嗅球介在ニューロンで特異的にNpas4をノックアウトしたマウスでは，二つの光学異性体のうちの片方の分子と砂糖を関連づけた匂い識別学習ができなくなるので，嗅球介在ニューロンにおける匂い刺激によるスパイン密度の制御は，嗅覚情報の精密な処理に必要であることが明らかになった^4）

• 4) Yoshihara, S., Takahashi, H., Nishimura, N., Kinoshita, M., Asahina, R., Kitsuki, M., Tatsumi, K., Furukawa-Hibi, Y., Hirai, H., Nagai, T., Yamada, K., & Tsuboi, A. (2014) Cell Reports, 8, 843–857.

図4 Npas4によるスパイン形成の制御機構

（A）野生型の嗅球介在ニューロンでは，匂い刺激によりNpas4の発現量が増加し，Mdm2の発現を抑制している．（B）Npas4を欠損した嗅球介在ニューロンでは，Mdm2の発現量が増加して，ダブルコルチン（Dcx）タンパク質の分解が促進される．Dcxはスパイン形成を促進するので，Npas4がDcxタンパク質の量を調節することにより，新たに作られるスパインの数を制御している．

Npas4遺伝子は嗅球介在ニューロンだけでなく，大脳皮質や線条体等の他の種類の抑制性ニューロンにおいても発現しているので，これらのニューロンの神経活動依存的なシナプス形成も制御していると推測されるが，その分子機構は不明である^8）

• 8) Spiegel, I., Mardinly, A.R., Gabel, H.W., Bazinet, J.E., Couch, C.H., Tzeng, C.P., Harmin, D.A., & Greenberg, M.E. (2014) Cell, 157, 1216–1229.

それに加えて，Npas4は医学的にも興味深い性質を持っている．脳梗塞モデルマウスにおいて，梗塞により障害された脳の周辺領域（penumbra）で，Npas4遺伝子の発現が顕著に上昇していることが報告されている^12）

• 12) Shamloo, M., Soriano, L., von Schack, D., Rickhag, M., Chin, D.J., Gonzalez-Zulueta, M., Gido, G., Urfer, R., Wieloch, T., & Nikolich, K. (2006) Eur. J. Neurosci., 24, 2705–2720.