生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

本稿では，細胞という特殊な場が生化学反応，ひいては生命システムに与える影響について議論する．システム生物学は生命現象をシステムとして理解しようという試みであり，そしてこのシステムの基礎となっているのが生化学反応である．システム生物学では，まず生命現象に関わる分子と生化学反応を特定し，続いて特定された要素で再構成したシステムが対象とする生命現象を再現することを示す，という手法が一般的である．しかし，in vitro（試験管内）にせよ，in silico（計算機上）にせよ，この再構成では多くの場合in vivo（生体内）とは異なる状況を前提としている．その差異の一つが生化学反応の起きている細胞という「場」である．細胞内は試験管内とは大きく異なる環境であり，生化学反応そして生命システムはこの特殊な環境に適応し，この環境をうまく利用しているように思われる．細胞環境は試験管内とさまざまな点において異なるが，主要なものとして（1）不均一性，（2）分子混雑，（3）少数性がある．（1）いうまでもなく細胞は真核・原核を問わずさまざまな細胞内小器官が存在し，膜によって区画化された不均一な環境である．いわゆるwell-stirred（濃度均一）な条件を前提とするin vitro系や従来のin silico系では，この不均一性の影響を正確に捉えることは難しい．たとえば，真核細胞のシグナル伝達系では，輸送シグナルによって核内と細胞質内の濃度差を利用している．また普通均一であると仮定される細胞質中でも，実際にはシグナルを受容する細胞膜付近とシグナルが伝わる先である細胞の中心部（細胞核表面）とでは分子濃度が異なる（濃度勾配）．（2）細胞内はリボソームなどの巨大分子によって非常に混み合った状況にある．一般に細胞質の容積のうちの20～30％が巨大分子によって占められている．再構成の際には対象とする生命現象に直接関わらないと考えられる分子は無視するが，実際にはこうしたその他大勢の分子がひしめきあう中で反応は起こる．たとえば巨大分子の排除体積効果は分子の拡散速度を下げる．しかしながら，単に拡散速度への影響を考慮するだけでは十分でないことも明らかになってきた．（3）加えて細胞は微小である．原核生物である大腸菌の細胞は1マイクロメートル，1フェムトリットル（10⁻¹⁸立方メートル），HeLa細胞でも数十マイクロメートル，数ピコリットル（10⁻¹⁵立方メートル）程度と，試験管で扱われる容積に比して圧倒的に小さい．微小な体積は同時に，そこに含まれる分子の数が非常に少ないことを意味する．極端な例としては，容積が0.1フェムトリットル程度の神経細胞の樹状突起スパインでは1マイクロモル濃度でも分子は60個にしかならない．分子数が少ないと反応の頻度も減り，分子数のゆらぎも相対的に大きくなる．こうした少数のゆらぐ分子が細胞の運命を決定づけていると考えられる例も実際に報告されつつある．さらに，以上で取り上げた細胞環境の特徴は相互に影響を与えている．分子の少数性は各分子の局在をきわだたせ，分子の混雑状況は細胞の場所によって大きく異なる．細胞内と試験管内の反応動態が常に異なるとはいえないが，細胞という特殊な環境が生化学反応から生命システムを再構成する際の「障壁」となっていることは疑いようがない．この問題に対して，近年の1細胞・1分子レベルでの計測技術やマイクロ流路を用いた生化学反応測定など計測技術の飛躍的な進歩は，これまで観察が難しかったさまざまな反応動態を詳細に測ることを可能にした．そこで我々は実験技術の進歩に呼応して，細胞環境を自然に表現できる新しい計算技法を開発し，これを利用して細胞環境が生化学反応に与える影響を理論としてまとめてきた．次節以降では，まず我々が開発した新規計算技法を紹介し，特に不均一性と分子混雑に関する細胞環境の影響を議論する．

システム生物学において，実験計測技術と計算技術は切っても切り離せない関係にある．計算されるモデルは測定可能な量に基づいており，たとえばシステム生物学において今日広く利用されている常微分方程式で記述された生化学反応ネットワークモデルは，分光法などによる酵素反応速度論とウェスタンブロッティングによるタンパク質量測定に対応するものだといえる．この手法で空間は，核や細胞質といった区画として表現される．そこでは暗黙のうちに，各区画内が常に十分攪拌された状態にあること，分子数が十分に多く，ノイズの影響がない「決定論的」な振る舞いをすることが仮定されている．一方，原核細胞の遺伝子発現系のように，分子数が少いためノイズの影響を無視できない「確率論的」な振る舞いが測定された系については，Gillespieアルゴリズムに代表されるモンテカルロ法が利用できる．さらに，カルシウムイオンなど蛍光プローブを用いた測定技術によって空間的な不均一性が観察される系については，偏微分方程式による反応拡散モデルがよく用いられる．これを応用して，空間を取り扱えるようにGillespieアルゴリズムを拡張した手法も開発されている．これらの手法は，空間を細かい区画に分割し，その間の拡散を反応の一種とみなすことで不均一性を表現している．しかしながら，非常に細かいとはいえ区画内では均一性を前提とする．この手法はイオンのような多数かつ拡散の速い小分子には適するが，少数かつ反応に比して拡散の遅い巨大分子の系では前提条件が満たされない場合がある．また，分子の数または濃度のみが問題とされ，分子の大きさは直接的には関わらない．さらに近年，蛍光顕微鏡技術の進展によって，1分子の反応拡散動態が直接計測され始め，前述の計算技法の空間的解像度を上回るまでになった．そこで我々は「ある種類の分子が何個存在するのか」を扱うのではなく，「ある分子が各々どの種類で，どの場所に存在するのか」を扱い，分子一つ一つの振る舞いを再現できる1分子粒度シミュレーション技法「拡張グリーン関数動力学法（以下，eGFRD法）」を開発した（図1

• 図1 eGFRD法による1分子粒度シミュレーション

図1 eGFRD法による1分子粒度シミュレーション

eGFRD法では，分子一つ一つを剛体球として三次元空間中に配置し，その拡散と反応をグリーン関数と呼ばれる厳密解に基づいて計算する．各時刻において，分子の周囲を三つ以上の分子が含まれないような仮想的な領域「保護領域」に分割し，その各々について厳密解を用いて計算することで，正確さを失わずに一度に大きな距離と時間幅を進められる．

多重リン酸化反応はシグナル伝達系において頻繁に観察される一般的な反応である．多重リン酸化反応によって二値的な応答が説明できることからシステム生物学における基本的な「素子」の一つとなってきた．我々はまず，この単純な二重リン酸・脱リン酸化反応系をeGFRD法を用いて計算し，さまざまな細胞内環境を再現した条件下で応答を調べた^1）

• 1) Takahashi, K., Tănase-Nicola, S., & ten Wolde, P.R. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 2473–2478.

図2 酵素の再結合による連続的な反応

二重リン酸化反応では一度目の反応直後，基質のごく近傍に解離した酵素の再結合によって連続的な反応が起こる（A）．1分子粒度シミュレーションを用いれば，さまざまな速度の反応において分子混雑が再結合を促進するようすを定量的に予測できる（B）．巨大分子の排除体積効果（C）や膜上のクラスター形成（D）など細胞環境の影響によって酵素の再結合が促進され，反応系の応答特性も変化する．

同じく分子の不均一性も酵素の処理能力に影響することが計算によって明らかになっている．受容体分子をはじめとしてさまざまな分子が細胞膜上に存在し，シグナル伝達の要となっている．これらの分子は膜上でクラスターと呼ばれる局在性（凝集）を示すことが多い．このような膜上での分子の不均一性が生化学反応にあたえる影響について調べるため，自由拡散する酵素と膜上にクラスターを形成する基質の反応について前節と同様に1分子粒度シミュレーションを行った^5）

• 5) Mugler, A., Bailey, A.G., Takahashi, K., & ten Wolde, P.R. (2012) Biophys. J., 102, 1069–1078.

細胞核内，特に染色体領域の分子混雑の状況はさらに複雑である．凝集したM期染色体はヌクレオソーム分子によって高い分子混雑下にある．転写因子など染色体の制御に関わる分子は，この入り組んだ状況で特定の対象を見つけ出し，適切に働くことが求められる．我々は国立遺伝学研究所の前島一博教授との共同研究で，染色体の動的な構造とその中で働く分子について1分子粒度シミュレーションを用いた解析を行ってきた．まず，染色体領域は間期からM期にかけてその凝集率が時間的に変化する．凝集率の高いM期における緑色蛍光タンパク質（GFP）五量体分子の拡散速度を凝集率の低い間期と比べた場合，2分の1ほどに低下したもののまだ核内を自由に拡散するようすが確認できた．しかし，混雑分子であるヌクレオソームは大局的にはほとんど動かないことが観察されており，シミュレーションの定量的な予測によればM期にはGFP五量体のような巨大分子はほとんど拡散することができないはずであった．このことから，実験で直接観察することは困難であるが，シミュレーション結果によればヌクレオソームがわずか数十ナノメートル程度の範囲で制限的にゆらいでいることが示唆された．この予測は実験的な計測とも矛盾しないことが裏づけられている^6）

• 6) Hihara, S., Pack, C.G., Kaizu, K., Tani, T., Hanafusa, T., Nozaki, T., Takemoto, S., Yoshimi, T., Yokota, H., Imamoto, N., Sako, Y., Kinjo, M., Takahashi, K., Nagai, T., & Maeshima, K. (2012) Cell Reports, 2, 1645–1656.

図3 1分子粒度シミュレーションで分子混雑下の分子の大きさの影響を計算する

分子混雑下にあるヌクレオソーム凝集領域（A）では，ヌクレオソームが局所的に動いているために中の分子は自由に拡散できる（B）が，小さい分子が領域内に自由に出入りできるのに対し，大きな分子は抜け出すことはできるものの侵入することは難しい（C）．（文献7から一部変更）

以上，1分子粒度シミュレーションによって明らかになった細胞環境の影響について，不均一性と分子混雑を中心にいくつかの例をあげて議論した．近年，1分子計測技術をはじめとした実験技術の進歩によって細胞環境の特殊性が明らかになりつつある．その一方で，細胞環境を再現または制御する技術はいまだ乏しく，酵素や基質を単離して行う生化学法によってその影響を測定することは非常に困難である．1分子粒度シミュレーションは，分子一つ一つを陽に表現することで細胞環境を自然に再現でき，条件を自由に変更してその影響について吟味，検証することができる．我々は計測と計算が協調して初めて細胞環境と生化学反応，ひいては生命システムの関係が明らかできるものと考えている．計測技術の革新的な進歩に遅れをとらぬよう，計算の高速化や精度の向上など我々もシミュレーション技術の開発に取り組んできた．その結果をさまざまな分野の研究者に広く自由に利用していただくため，細胞シミュレーションソフトウェア基盤E-Cellシステムバージョン4を開発し，無料で公開している^8）

• 8) https://github.com/ecell/ecell4

最後に，本稿で紹介した研究は基礎生物学研究所・青木一洋教授，国立遺伝学研究所・前島一博教授，オランダ原子分子物理研究所・Pieter Rein ten Wolde教授と共同で行われたものです．この場を借りて深謝いたします．