生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

1）細胞遊走の制御

S1Pは血漿中に1 µM程度の濃度で存在し，キャリアタンパク質であるApoM含有HDLもしくはアルブミンに結合した状態で存在する^1）．S1Pはリンパ球の細胞膜に発現するS1P受容体1（S1P₁）に結合することで，胸腺や脾臓などのリンパ組織から血液中やリンパ液中へのリンパ球移動を促進する（図1）．生後3～5日目のマウスにおいて，スフィンゴシンキナーゼ1（Sphk1）と2（Sphk2）を両方欠損させると，血漿中のS1Pが消失し，血液中のリンパ球数は大きく減少し，胸腺での成熟Tリンパ球の蓄積がみられる^2）．このマウスの血液中にS1Pを投与すると血液中のリンパ球数は増加し，野生型のマウスから採取した赤血球を投与した場合でも血漿のS1P濃度が上昇することで胸腺での成熟Tリンパ球の蓄積が減少する．したがって，赤血球から血漿中に供給されるS1Pは胸腺から血液へのリンパ球移動に寄与している．しかし一方で，放射線照射した野生型マウスにSphk1, 2欠損マウスの骨髄を移植した場合，血漿中のS1P濃度が野生型マウスの骨髄を移植した場合の10分の1になるが，血液中のリンパ球数は正常である^2）．この結果は，血球以外の細胞も血漿中にS1Pを供給しており，リンパ球移動にはその程度の血漿中S1P濃度で十分だということを示している．

図1 赤血球が血液中のS1Pシグナリングの中心である

二次リンパ組織からのリンパ球の血中移行には，血管内皮細胞のSPNS2から供給されるS1Pと二次リンパ組織と血漿との間のS1P濃度勾配が必須である．血漿中のS1Pの半分は赤血球からMFSD2Bを介して供給される．また，赤血球由来のS1Pは血管強度の維持にも重要である．

リンパ球以外では，骨髄から血液中への造血幹細胞・前駆細胞の移動^3）や破骨前駆細胞の運動制御^4）に血漿中のS1Pが関与することが報告されている．

2）血管形成・血管バリアへの関与

赤血球特異的にSphk1とSphk2の両方が欠損することで，マウスは血管形成不全のため胎生致死となることから，赤血球由来のS1Pが胚発生時の血管形成に必須であることが示されている^5）．また，生後3～5日目に組織非特異的にSphk1とSphk2の両方を欠損させた場合には，マウスの血漿中S1Pがなくなり，血管漏出が増加してアナフィラキシーや炎症の惹起に対し感受性が増す^6）．この血管漏出は，野生型マウス由来の赤血球を注入することにより回復することから，赤血球由来のS1Pが血管強度の維持にも関与することが示唆されている．また，ラットにおいても赤血球由来のS1Pが，毛細血管の透過性を抑制することが報告されている^7）．

前述のとおり，赤血球が血漿中S1Pの供給において重要な役割を果たすことがわかってきたが，細胞内で生成されたS1Pが細胞外へと放出される現象の報告は，1995年の矢冨らによる血小板からの刺激依存的なS1P放出が最初である^8）．その後1999年に赤血球・好中球・単核細胞からの刺激非依存的なS1P放出活性がYANGらによって^9），肥満細胞からの刺激依存的なS1P放出がJollyらによって報告された^10）．血球細胞以外では，血管内皮細胞が刺激非依存的にS1Pを放出することが2007年にLeeらによって報告されている^11）．血小板は非常に高濃度のS1Pを蓄積しており，ヒトでは1細胞あたりの細胞内S1P量は赤血球の約9倍である^12）．しかし赤血球は血小板よりも細胞数が圧倒的に多いため，血液中のS1P量としては赤血球の方が多く，ヒトでは血液中のS1Pの51％が赤血球に，30％が血小板に，13％が血漿に存在する^12）．血小板を実質的に欠失させたマウスの血漿中S1P濃度は野生型マウスと同程度であることから^2），血漿中のS1P濃度に対する血小板の寄与は小さい．赤血球，血管内皮細胞は細胞内で合成されたS1Pを刺激非依存的で恒常的に放出することから，血漿中のS1P濃度に対する寄与が大きいと考えられる．

S1Pを含む脂質メディエーターは脂溶性が高いことから当初，輸送体を介した細胞外放出機構についてあまり考えられていなかった．しかし，特に血小板においてS1Pは高濃度に細胞内に蓄積されているが，受動拡散により細胞外へ放出されない．これはS1Pが親水性のリン酸基を持っているためであり，S1Pの細胞外放出は細胞膜の輸送体を介しているのではないかと考えられた．そこで我々は血小板のセミインタクト細胞を用いて，S1Pの細胞外放出の機構を詳細に解析し，血小板からの刺激依存的なS1P放出が細胞内顆粒の開口放出によるものではないことを示すとともに，細胞膜に存在する輸送体がS1Pを細胞膜内葉から外葉に輸送し，これをS1Pキャリアタンパク質が受け取り細胞外液中に移行させることを明らかにした^13）．さらにこの結果は，細胞膜のみを持ち，刺激非依存的にS1Pを放出する赤血球からのS1Pの放出も細胞膜の輸送体を介している可能性を示唆していた．特に赤血球はこれまでに多くの生化学的解析がなされ，血小板に比べて解析が容易であるため，S1P輸送体の実体を明らかにするために最適であると考えた．実際，赤血球の反転膜を用いた生化学的な解析から，赤血球にはキャリアタンパク質としてアルブミンを必要とする，ATP依存的なS1P輸送体が細胞膜に存在することを明らかにできた^14）．赤血球と血小板のS1P輸送体はともにATP依存的であり，glyburideにより阻害されるという共通の特徴を持っていた^{13, 14）}．赤血球からのS1P放出にはキャリアタンパク質としてアルブミンもしくはHDLが必要であり，ApoMはS1Pが直接結合するタンパク質として赤血球からHDLへのS1P放出を促進することが示されている^15）．

S1P輸送体として，最初にマスト細胞の遺伝子ノックダウン実験によりABCC1の関与が示唆されてから^16），細胞での遺伝子発現抑制による細胞外S1P放出量の減少を指標に，いくつかのABC輸送体のS1P輸送への関与が示唆された^17–22）．しかし，これらのABC輸送体は我々の確立したS1Pを高濃度に蓄積する培養細胞を用いたS1P放出輸送体機能解析系に発現させても，細胞外へのS1P放出活性を示さないことから，単独ではS1Pを輸送しないと考えている^23）．

このような状況の中で，我々は生理的に機能するS1P輸送体としてSPNS2を初めて同定した^24）（詳細は川原らの稿参照）．SPNS2はマウスでは血管内皮細胞に発現しており，SPNS2欠損マウスの血管内皮細胞からのS1P放出は完全に消失していたにもかかわらず，赤血球および血小板からのS1P放出はまったく変化がなかった．このことから，これらの細胞にはSPNS2ではない別のS1P輸送体が存在すると考えられた^25）．

赤血球のS1P輸送体を同定するため，我々は生化学的な解析に成功していた赤血球反転膜を用いて，S1Pのアミノ基に光架橋基を結合させたS1Pアナログを作製し，アフィニティーラベリングによるS1P輸送体の精製を試みたが，ほとんどがBand3などの赤血球に多く存在する膜タンパク質に反応し，S1P輸送体分子の同定には至らなかった．光架橋基がかさ高く，S1Pの親水性部分の構造が大きく変わるため，S1P輸送体により認識されなかった可能性が高い．それに並行して，脂質や薬剤の排出輸送体，ABC輸送体，赤血球膜での発現が確認されている輸送体，さらにS1P輸送体であるSPNS2と相同性の高いSLC輸送体など50種類以上の輸送体を調べたが，S1P輸送活性を示すものはなかった^26）．

そこで遺伝学的な手法を試みようとしたが，赤血球はDNAを持たない細胞であり遺伝学的な手法が使えないため，赤血球と同様のS1P放出輸送活性を持つ培養細胞の探索を進めた．さまざまな培養細胞を試した中，分化誘導したK562細胞において初めて弱いS1P放出活性を観察することができたが，再現性が悪く使用を断念した．その後，マウスES細胞からの分化誘導により樹立された赤血球前駆細胞株（MEDEP-E14, MEDEP-BRC4-1, MEDEP-BRC5）^27）がより赤血球に近い性質を有することがわかり，これらの細胞を試すことにした．細胞にS1Pの前駆体であるスフィンゴシンを添加すると，いずれの細胞株でも細胞内でS1Pが合成され，細胞外へ放出されることがわかった（図2）．我々はこれらの赤血球前駆細胞株のうち，最もS1P放出活性の高かったMEDEP-E14細胞を用いてさらに研究を進めた．MEDEP-E14細胞の親株細胞であるE14TG2a細胞ではスフィンゴシンの添加により細胞内で少量のS1Pが合成されたが，細胞外へのS1P放出はみられなかった．そこでMEDEP-E14細胞とE14TG2a細胞のS1P放出能の違いに着目し，マイクロアレイにより遺伝子発現の差異を解析した．E14TG2a細胞には発現せず，MEDEP-E14細胞のみに高発現している輸送体遺伝子を上位から抽出したところ，順にSlc28a2, Slc14a1, Mfsd2bを見いだした．これらの遺伝子をそれぞれスフィンゴシンキナーゼを安定発現させたCHO細胞に一過的に発現させたところ，MFSD2BのみがS1P放出輸送活性を示した．安定発現株を用いた解析でもMFSD2BはSPNS2に匹敵するS1P放出活性を示し，マウスおよびヒトのMFSD2Bともに高いS1P輸送活性がみられた^26）．MEDEP-E14細胞やMFSD2Bを発現させた細胞からのS1P放出輸送活性は，赤血球と同様に刺激非依存的であり，glyburideにより阻害された^26）．実際に，MEDEP-E14細胞でMfsd2b遺伝子をCRISPR/Cas9システムにより欠損させると，アルブミンおよびHDL依存的なS1P放出活性が大きく減少したことから，MEDEP-E14細胞におけるS1P輸送体はMFSD2Bであることを確認した（図3）^26）．マウス個体においてMfsd2bはmRNAレベルで特に骨髄で高発現しており，また，タンパク質レベルでは赤血球膜で強い発現が確認できたことから，MFSD2Bが赤血球のS1P輸送体として機能していることが強く示唆された^26）．

図2 赤血球前駆細胞株からのS1P放出

確立されている3種類のマウス赤血球前駆細胞株（MEDEP-E14, MEDEP-BRC4-1およびMEDEP-BRC5）の細胞外にスフィンゴシンを添加すると，細胞内に取り込まれS1Pに変換される．スフィンゴシン添加後の各時間における細胞外へのS1P放出量を測定した．

図3 赤血球前駆細胞株からのキャリアタンパク質濃度依存的なS1P放出

赤血球前駆細胞株MEDEP-E14を用い，生理的なS1Pキャリアタンパク質であるアルブミン（ここではBSA）とHDLの異なる濃度におけるS1P放出への影響を調べた．またMEDEP-E14細胞のMfsd2b遺伝子をCRISPR/Cas9システムを用いて欠損させた細胞株からのキャリアタンパク質依存的なS1P放出も示した．**は有意差P＜0.01.

MFSD2BのホモログであるMFSD2Aは，2014年にリゾホスファチジルコリン（LPC）輸送体として同定され，血液脳関門の血液側細胞膜に発現することから脳へのドコサヘキサエン酸（DHA）取り込みに必須の輸送体である^28）．MFSD2Aは，DHAを含むLPCをNa^＋との共輸送により細胞内へ取り込むが，S1Pを取り込むことはできない^28）．MFSD2BとMFSD2Aでは基質の輸送方向が異なるが，アミノ酸配列の同一性が42％と非常に高く，基質であるS1PとLPCは分子構造も類似していることから，MFSD2BによるS1P輸送もNa^＋かK^＋の濃度勾配に依存することが推測された．しかし，MFSD2BによるS1P輸送活性は，Na^＋濃度勾配やK^＋濃度勾配を消失させても変化せず^26），また，H^＋イオノフォアのNigericinでもS1P輸送は阻害されないことから（非公開データ），H^＋濃度勾配も必要ないと思われる．MFSD2Aにおいては結晶構造がすでに明らかとなっている細菌のMFS型輸送体MelBとのホモロジーモデリングにより，イオン共役や基質結合に関与する荷電性アミノ酸残基が報告されている^29）．それら荷電性アミノ酸残基のうち，MFSD2Bにおいて保存されているAsp85およびLys413をAlaに置換した変異体ではS1P輸送活性が大きく減少したことから，これらのアミノ酸残基はイオン共役を必要としないMFSD2BにおいてもS1P輸送活性に重要であることが明らかとなった^26）．Lys413については相同するMFSD2Aの残基がLPCのリン酸基の認識に関与すると考えられており，S1Pもリン酸基を持つことから同様の役割を果たしている可能性がある（図4）．Na^＋共役型輸送体のNa^＋の結合部位においては3個の荷電性アミノ酸残基を含む6個のアミノ酸残基が立体構造上でクラスターを形成することが知られており^30），MFSD2Aでは二つのアスパラギン酸残基を含む三つのアミノ酸残基がそのクラスターを形成すると推定されている．MFSD2Bでは同じ位置に保存されたクラスターが存在せず，唯一保存されているAsp85がS1P輸送でイオン共役以外にどのような役割を果たしているのか興味深い．

図4 脂質輸送体モデルにおける基質輸送に必須の荷電性アミノ酸残基の比較

SPNS2, MFSD2B, MFSD2Aおよび脂質スクランブラーゼTMEM16Fのホモロジーモデリングによる推定構造を示した．TMEM16Fは二量体で機能することが報告されているが，ここでは単量体を示し，鋳型のnhTMEM16とアライメントできない部分を一部削除している．それぞれの脂質輸送体においてS1Pなどの基質の輸送に必須であると報告されている残基を示した．基質となる脂質は膜上に示し，脂質のリン酸部位を丸で示している．

血管内皮細胞のS1P輸送体であるSPNS2とMFSD2Bのアミノ酸配列を比較した場合，有意な相同性を示さないが，機能的な特徴は類似している．SPNS2もS1P輸送活性にイオン濃度勾配を必要としない．また，これまでに複数の正電荷を持つアミノ酸残基がS1P輸送活性に必須であることがわかっている（未発表）．しかし，少なくともSPNS2とMFSD2Bのホモロジーモデルにおいては輸送活性に必須の荷電性アミノ酸残基の位置が異なっており^26），S1P輸送の分子機構については高次構造の解明などさらなる研究が必要である．脂質スクランブラーゼであるTMEM16Fにおいてもホスファチジルセリンの細胞膜外葉への輸送に正電荷および負電荷を持ったアミノ酸残基が重要であることが報告されており，基質との相互作用が示唆されている^31）．これらの脂質輸送体では脂質を認識する極性残基が基質とアクセスしやすい場所に存在しており，これらの極性残基と脂質のリン酸基などの極性部位が相互作用して脂質を輸送している可能性が考えられる（図4）．

S1Pは脂溶性が高い物質であることから，血漿中のS1Pはキャリアタンパク質に結合して存在しており，そのうちの約60％はApoMとともにHDLに，35％はアルブミンに存在している^1）．MEDEP-E14細胞において，これらのS1Pキャリアタンパク質依存的なMFSD2BによるS1P放出輸送を生理的なアルブミン濃度（3.5％BSA）および生理的なHDL濃度（500 µg/mL）で測定したところ，これまで実験的に用いていた1％BSAと同程度であった（図3）．したがって，赤血球から供給されるS1Pはin vivoにおいてもMFSD2BからアルブミンとHDLに対し同程度で受け渡されていることが示唆された^26）．SPNS2とMFSD2BにおけるアルブミンおよびHDLに対するS1P輸送量の違いや輸送機構の違いについては今後の検討課題である．

我々が赤血球前駆細胞株MEDEP-E14において新規S1P輸送体MFSD2Bを同定したのと同時期に，VuらもMFSD2Bが赤血球のS1P輸送体であることを報告し，さらにMFSD2B欠損マウスの解析結果も示した^32）．まず，MFSD2Bの欠損により赤血球および血小板のS1P放出活性が完全に抑制されることから，MFSD2Bが赤血球および血小板のS1P輸送体であることが示された^32）．血漿中のS1P濃度は野生型の50％程度に減少したが，SPNS2欠損マウスの場合（SPNS2欠損により血漿中S1Pが野生型の約60％に減少）とは異なり，リンパ球移動はほとんど影響がなかった．前述のとおり，これまでに赤血球由来のS1Pが発生期の血管形成に必要であることが示されていたが^5），血漿中S1P濃度が保たれているためか，血管強度についても影響がなかった．MFSD2B欠損の影響が出たのは，アナフィラキシーショックに対する感受性の上昇と，赤血球自体の脆弱性に関係した表現型である．MFSD2B欠損マウスでは口唇状赤血球症を伴う溶血を示し，溶血はストレス誘導性の赤血球新生において悪化した．これらの結果はMFSD2BによるS1P放出が，赤血球の形態維持に重要であることを示している．MFSD2B欠損マウスの赤血球には野生型の40倍程度のS1Pやスフィンゴシンが蓄積することから，界面活性剤様の作用を持つS1Pが赤血球細胞膜の構造に悪い影響を与えるのかもしれない．実際に我々が赤血球の反転膜小胞を用いてS1P輸送活性を測定する際にも，高濃度のS1P添加により細胞膜が不安定になることを示唆する実験結果を得ている^14）．これまでに，血漿中のS1Pを失ったマウスはアナフィラキシーショックに対して感受性になることが報告されており，赤血球および血小板由来のS1Pは，ともにアナフィラキシーショック時の急激な血漿中S1P欠乏には必須である^33）．

現在では，S1Pの多面的な働きが知られるようになったが，やはりリンパ球の遊走におけるS1Pの役割は特に重要である．S1P受容体の機能的アンタゴニストであるFTY720（フィンゴリモド）には免疫抑制作用があり，現在多発性硬化症の治療薬として使われている．これまでに，S1P受容体を介した情報伝達やS1Pの代謝については早い段階でその分子機構の解明が進んでいたが，リンパ組織から血液中へのリンパ球移動に必要な血漿中のS1Pを産生し供給する細胞からのS1P放出機構についてはあまり注目されていなかった．我々は，赤血球や血管内皮細胞において，S1Pが輸送体を介して放出されているのではないかと考え，その分子機構の解明を進めてきた．その過程で血小板と赤血球の生化学的解析からS1Pが輸送体を介して放出されることを明らかにし，血管内皮細胞のS1P輸送体であるSPNS2を同定した．SPNS2欠損マウスでは血漿中のS1Pが野生型マウスの60％程度までしか減少しないのにもかかわらず，リンパ組織から血液中へのリンパ球移動は大きく減少した．一方，最近我々が同定した赤血球S1P輸送体のMFSD2Bは，MFSD2B欠損マウスにおいて血漿中のS1Pが野生型マウスの半分まで減少するがリンパ球移動は大きく影響を受けない．これらの結果は，リンパ組織から血液中へのリンパ球移動が，S1P濃度の低いリンパ組織と血液との間で形成されるS1P濃度勾配をリンパ球が認識することによってのみ引き起こされるのではないことを示している．我々は血管内皮細胞のSPNS2が血漿中にS1Pを供給する以外に，リンパ組織にいるリンパ球に対して直接的に働きかけることでリンパ球の移動を制御しているのではないかと考えている．

我々が生化学的解析から示してきたとおり^{13, 14）}，赤血球と血小板からのS1P放出はともにMFSD2Bという輸送体が担っていることが明らかとなった．血小板は刺激依存的にS1Pを放出することから，同じ輸送体を介したS1P放出機構の違いを解明していきたい．また，多発性硬化症治療薬フィンゴリモドは主に血小板に存在するスフィンゴシンキナーゼ2によりリン酸化され活性化体となり，血漿中に放出されることが報告されているが^34），MFSD2B欠損マウスでもフィンゴリモド投与によるリンパ球の血中移行阻害が観察されることから，MFSD2Bがフィンゴリモドの活性化体の輸送に関与しているかどうか興味深い．

血管内皮細胞のS1P輸送体SPNS2はリンパ球移動の他に，がんの進行への寄与も示唆されている^35）．MFSD2Bについても，S1Pが関係する生理機能や病態への関与を今後明らかにし，S1P輸送体によるS1Pシグナル制御の全体像の解明を目指していきたい．