生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

さまざまなタンパク質がユビキチン修飾を受け，プロテアソームに認識され分解されることが知られている．一方，膜タンパク質がプロテアソームに認識され分解されるためには，膜から引き抜く機構が必要となるが我々はその機構に依存しない分解経路を報告したので紹介したい．受容体型チロシンキナーゼErythropoietin-producing human hepatocellular（Eph）B2は，さまざまながん細胞で高発現している1回膜貫通タンパク質であるが，興味深いことにがん遺伝子あるいはがん抑制遺伝子として真逆の役割が報告されている^{1, 2）}．このEphB2の細胞外ドメインはリガンドであるエフリン（ephrin）刺激依存的にメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinase；MMP-2/MMP-9）で切断除去される．一方，残りの部分は細胞膜貫通領域が残っているために細胞膜に局在するが，その後，γセクレターゼにより切断されチロシンキナーゼ活性を持つ細胞内ドメインは細胞質に遊離する．細胞内ドメインはプロテアソーム依存的に分解されることが知られていたが，対応するユビキチンリガーゼは不明であった．

我々はSPRY domain and SOCS box-containing protein（SPSB）4がEphB2を認識するユビキチンリガーゼであることを最近報告したので紹介したい^3）．また，EphB2は細胞間反発運動を引き起こす受容体であることが知られていたが（エフリン発現細胞とEphB2発現細胞が接触すると互いに遠ざかる方向へ移動する）^4），SPSB4ノックダウンによりEphB2細胞内ドメインの蓄積と細胞間反発運動の亢進がみられた．これらのことはSPSB4がEphB2を介した細胞間反発運動を抑制し，適切な細胞内局在やがん浸潤などに関与している可能性を示唆している．

ユビキチンリガーゼSPSB4はSPRY［repeats in spore lysis A（splA）and ryanodine receptor（RyR）］ドメインとSOCS（suppressor of cytokine signaling）ボックスを有するタンパク質であり，SPSB1, SPSB2, SPSB3, SPSB4からなるファミリーの一員である（図1）．SPRYドメインはタンパク質間相互作用に寄与し，SOCSボックスはユビキチンリガーゼ活性に寄与する^{5, 6）}．我々はSPSBファミリーの基質タンパク質を探索するため，FLAGタグを付加したSPSB1, SPSB2, SPSB3, SPSB4をヒト胎児腎細胞293T（HEK293T）にそれぞれ発現させ，FLAG-SPSB1, FLAG-SPSB2, FLAG-SPSB3, FLAG-SPSB4に結合するタンパク質を抗FLAG抗体を用いた免疫沈降により精製した．免疫沈降サンプルをSDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）で分離し，トリプシン消化後，質量分析機を用いて各結合タンパク質を同定した．その結果，SPSB1とSPSB4の基質候補としてEphB2を同定した．質量分析の結果を確認するため，EphB2を発現させたHEK293T細胞にそれぞれのSPSBファミリータンパク質を同程度発現させ，EphB2との結合を比較した結果，SPSB1あるいはSPSB4との結合が確認できた．特にSPSB4が強くEphB2と結合した．SPSBファミリーのうちSPSB1とSPSB4のアミノ酸配列の類似性が高いこともこの結果を支持すると考えられる^7）．EphB2のリガンドの一種であるephrin-B2刺激による影響を解析したところ，リガンド刺激はSPSB4とEphB2の結合に影響しないことが明らかとなった．次に内在性EphB2との結合を確認するためにさまざまな細胞株を解析した結果，大腸がん細胞株Colo201がEphB2を発現していることを見いだした．SPSB1あるいはSPSB4を安定発現させたColo201細胞を用いて内在性EphB2との結合を比較したが，SPSB4の発現がSPSB1よりも強かったため比較することはできなかった．しかしながら，すべてのデータを考慮すると主にSPSB4がEphB2を認識するユビキチンリガーゼであると推測された．すでに報告されているようにephrin-B2刺激はEphB2の切断を引き起こすが，プロテアソーム阻害剤存在下ではいくつかの長さの違うフラグメント（long fragment：LF, C-terminal fragment：CTF, EphB2/LF, EphB2/CTF1, EphB2/CTF2）が確認される^{8, 9）}（図2）．そこでEphB2細胞内ドメイン（EphB2-CD）に対するユビキチン修飾をin vivoで解析した．HEK293T細胞にFLAG-タグを付加したEphB2-CD-FLAG, HAタグを付加したSPSB1（HA-SPSB1），HA-SPSB2, HA-SPSB3, HA-SPSB4，ヒスチジンタグを付加したユビキチン（His₆-Ub）を発現させ，8 Mol/L尿素存在下でニッケルビーズを用いてHis₆-Ubを精製した．SDS-PAGEで分離後ウェスタンブロッティングを行い，抗FLAG抗体を用いてEphB2-CD-FLAGを検出し，ユビキチン化による分子量の増加を解析した．HA-SPSB1, HA-SPSB2, HA-SPSB3, HA-SPSB4を同程度発現させることができなかったため単純に比較できなかったが，HA-SPSB4を発現させるとEphB2-CD-FLAGのユビキチン化が亢進したため，SPSB4はEphB2-CD-FLAGを標的とするユビキチンリガーゼであることが示された．EphB2の597番目と603番目のチロシン残基はキナーゼ活性に必要であることが報告されており^10–12），キナーゼ活性の有無がSPSB4との結合に関与しているかを調べた結果，野生型とY597/603F二重変異体どちらもSPSB4と結合したため，EphB2のキナーゼ活性はSPSB4との相互作用に影響しないことが明らかとなった．この結果はリガンド刺激がEphB2とSPSB4の結合に影響しないことと一致する．これらの結果より，SPSB4がEphB2細胞内ドメインに対する主要なユビキチンリガーゼであると結論づけた．

図1 SPSB4の構造

273アミノ酸からなる．SPRYドメインはタンパク質間相互作用に寄与すると考えられる．BCボックスはElongin B, Elongin Cと結合する．Cul5ボックスはCullin 5と結合する．BCボックスとCul5ボックスを合わせてSOCSボックスという．SOCSボックスを有するタンパク質はユビキチンリガーゼ活性を持つことが多い．

図2 リガンド刺激によるEphB2の切断とプロテアソーム依存的分解

EphB2がリガンドであるエフリン（図中ではephrin-B2）と結合すると細胞膜外や細胞膜内で切断され，いくつかの断片を生じる．これらはその長さによってEphB2/LF, EphB2/CTF1, EphB2/CTF2に分類される．これらの断片はSPSB4に認識されユビキチン修飾を受けた後，プロテアソーム依存的に分解される．また，EphB2刺激は細胞間反発運動を誘導する．

SPSB4によるEphB2の分解誘導がどのような生理的役割を担っているのかを明らかにするために，SPSB4ノックダウンColo201細胞を樹立した．リガンド刺激により全長EphB2は細胞膜内で切断され，細胞外ドメインと細胞内ドメインに分かれるがSPSB4ノックダウンはこの切断に影響しなかった．また，リガンド刺激しなくてもEphB2細胞内ドメイン（EphB2-CD）の切断産物（EphB2/LF, EphB2/CTF1, EphB2/CTF2）が検出されたので，Colo201細胞は通常培養条件下で何らかの微弱な刺激を受けていると考えられた．予想どおりSPSB4ノックダウンによりEphB2細胞内ドメインの切断産物（EphB2/LF, EphB2/CTF1, EphB2/CTF2）が蓄積したが，EphB2/CTF1あるいはCTF2の蓄積はリガンド刺激しない場合においてのみ有意差が確認できた（リガンド刺激すると有意差はなかった）（図3）．一方，EphB2/LFはSPSB4ノックダウンにより顕著に蓄積した．これらのEphB2切断産物（EphB2/LF, EphB2/CTF1, EphB2/CTF2）はSPSB4ノックダウン細胞内においてもリガンド刺激により徐々に分解されたので，SPSB1を含む他のユビキチンリガーゼか関与していることが示唆された．これらの結果より，SPSB4はEphB2切断産物を認識しユビキチン修飾するユビキチンリガーゼであると考えられた．

図3 SPSB4ノックダウンによるEphB2/LF, EphB2/CTF1, EphB2/CTF2の蓄積^3）

（A）コントロールあるいはSPSB4ノックダウンColo201細胞をエフリン（ephrin-B2）刺激した．経時的に細胞を回収しEphB2量を定量した．全長EphB2は刺激依存的に切断され減少する．（B） EphB2/CTF1あるいはCTF2の定量データ．（C） EphB2/LFの定量データ．*: p＜0.03, **: p＜0.01.

EphB2発現細胞がephrin-B2発現細胞と接触すると互いに遠ざかる方向へ移動する（細胞間反発運動）ことが知られている^4）．したがってSPSB4ノックダウンによるEphB2切断産物の蓄積は細胞間反発運動に影響を与えることが予想された．それを検証するためにephrin-B2を発現するHEK293T細胞と，緑色蛍光タンパク質（enhanced green fluorescent protein：EGFP）を発現するSPSB4ノックダウンColo201細胞を共培養した（蛍光を放つ細胞はColo201細胞である）（図4）．2×10⁵個のHEK293T細胞とColo201細胞を混合して6穴プレートで3日間培養を行い，細胞間反発運動を観察した．このアッセイ系においては，0日目は低密度であるので細胞は自由に移動しながら増殖できる．細胞間反発運動によりephrin-B2を発現するHEK293T細胞と，EphB2を発現するColo201細胞が接触すると互いに離れる向きに移動する．3日目には高密度になっており，細胞間反発運動の結果HEK293T細胞とColo201細胞はそれぞれの細胞集団を形成する．Colo201細胞をephrin-B2発現HEK293T細胞と共培養すると予想どおりColo201細胞集団の形成が確認できた．細胞間反発運動によりephrin-B2発現HEK293T細胞とColo201細胞が互いに逃げるように動くため，それぞれの細胞集団が形成されるが一部のColo201細胞は逃げ遅れ，HEK293T細胞集団の中に取り込まれコロニーを形成できない．ランダムな視野を選び，コロニーを形成していないColo201細胞の数を数え比較した（図4B）．コントロールHEK293T細胞あるいはephrin-B2発現HEK293T細胞から逃げ遅れ，HEK293T細胞集団に取り込まれたColo201細胞数に大きな変化はみられなかった．一方，SPSB4ノックダウンColo201細胞をephrin-B2発現HEK293T細胞と共培養すると，コントロールColo201細胞の場合よりも大きな細胞集団を形成した．また，HEK293T細胞集団に取り込まれたコロニーを形成していないSPSB4ノックダウンColo201細胞数はコントロールColo201細胞の場合に比べて少なかった．これらの結果は細胞間反発運動がSPSB4ノックダウンにより増強されていることを示している．すなわち，SPSB4はEphB2切断産物（特にEphB2/LF）の分解を誘導することで細胞間反発運動を抑制していることが示唆された．

図4 SPSB4による細胞間反発運動の抑制^3）

（A） Colo201細胞はEGFP発現により蛍光を発する．コントロールあるいはSPSB4ノックダウンColo201細胞をコントロールあるいはephrin-B2発現HEK293T細胞と3日間共培養した．スケールバー: 100 µm. （B）「逃げ遅れた」Colo201細胞数の比較．細胞集団を形成していないColo201細胞を「逃げ遅れた」細胞として数えた．*: p＜0.03, **: p＜0.01. N.S.: 有意差なし．四つの視野をカウントした．平均値±標準偏差．

EphB2は1回膜貫通タンパク質であるが，ユビキチン修飾依存的に分解される過程において膜から引き抜かれる必要はなく，細胞膜内における切断が重要であることが示された．細胞間反発運動は細胞の適切な配置やシナプス形成，がん細胞の浸潤や転移などに関与する重要なメカニズムの一つである．TCG Aデータベース（https://cancergenome.nih.gov/）を用いてEphB2, SPSB1, SPSB2, SPSB3, SPSB4それぞれの発現をさまざまな種類のがんで比較したところ，SPSB4を除いてがんの種類による大きな違いは認められなかった．SPSB4の発現は大腸がん，びまん性大細胞型B細胞リンパ腫，肝細胞がん，皮膚黒色腫，前立腺腺がん，甲状腺がん，ぶどう膜メラノーマ，腎細胞がんなどで低下していることが示された．一方，SPSB4の発現は星状細胞腫，グリア芽腫，乏突起膠腫で亢進している^13）．したがってこれらのがん細胞ではEphB2細胞内ドメインの切断産物（EphB2/LF, EphB2/CTF1, EphB2/CTF2）が蓄積あるいは減少していることが推測される．EphB2はがん遺伝子あるいはがん抑制遺伝子として真逆の役割が報告されており^{1, 2）}，解析条件や解析に用いた細胞の違い，未知のファクターなどが関与していると考えられるが詳細は明らかとなっていない．特にEphB2/LFの蓄積や減少が予想されるので，下流のシグナル伝達経路や，がん遺伝子として働くのか，あるいはがん抑制遺伝子として働くのかを含めて今後解析することは，さまざまな種類のがんの性質を理解する上で重要であると思われる．今後，解析が進むことでEphB2の生理的役割が解明されるはずである．