生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

ユビキチンは，他のタンパク質に共有結合し，タンパク質分解をはじめ，免疫応答やDNA修復といった幅広い生命現象に関わる^1）．最も特徴的な点はユビキチンがいくつも重合し，ポリユビキチン鎖を形成することである．現在，8種類のポリユビキチン鎖（M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63結合型）が同定されている^1）．細胞内では，各結合型のポリユビキチン鎖を合成するE1–E2–E3ユビキチン化酵素群が大量に存在しており，細胞内各所で起こるユビキチン化反応に迅速に対応できる．一方，細胞内には脱ユビキチン化酵素（deubiquitinating enzyme：DUB）も豊富に存在しており，合成されたユビキチン鎖はモノユビキチンまで即座に切断される^2）．このように細胞内ではユビキチン鎖の合成反応と切断反応が拮抗することにより，細胞内タンパク質上に形成されるユビキチン鎖はさまざまな長さを持ち，4鎖長以上の長鎖のポリユビキチン鎖も存在する．近年，分岐鎖や混合鎖といった，一つの結合型ではなく複数の結合型から構成されるユビキチン鎖が発見されており^3–8），より鎖長が長く複雑なポリユビキチン鎖の生物学的機能に注目が集まっている．

では，細胞内では長いポリユビキチン鎖は機能上の役割があるのであろうか．Throwerらは，試験管内の実験でK48結合型のポリユビキチン鎖は4鎖長以上がプロテアソームとより強く相互作用することを見いだしている^9）．一方，X線結晶構造解析や核磁気共鳴法（NMR）で決定された複合体構造からわかることは，各結合型のポリユビキチン鎖の認識は2鎖長で十分であり，必ずしも長い鎖が必要でないことである^1）．では，長い鎖の存在意義はプロテアソームとの相互作用を高める機能だけなのだろうか．もしくは単なる細胞内の酵素反応の過剰反応の産物なのだろうか．しかし，どのユビキチン鎖の合成にも細胞内のエネルギー源であるATPが大量に消費される．単なる過剰反応物であれば，細胞はむだなエネルギーを消費してしまっていることになる．

そこで筆者らははじめ，長鎖のポリユビキチン鎖に構造学的な特徴があるのではないかと考え，M1結合型ポリユビキチン鎖の2鎖長から6鎖長までを大腸菌大量発現系で調製することを試みた．しかし，想定外にすべてのポリユビキチン鎖の調製に失敗してしまった．その原因は後にわかることになるのだが，筆者らはモノユビキチンのタンパク質調製方法をそのままポリユビキチン鎖に踏襲してしまっており，pH 4.5の酸性緩衝液中，85°Cで15分間インキュベートし夾雑タンパク質を選択的に沈殿させる精製ステップがポリユビキチン鎖の精製には問題であった．この失敗から，筆者らはポリユビキチン鎖にはモノユビキチンとは明らかに異なる物性があると考え，構造学的な特徴のみではなく，他の物理化学的な特徴も調べることにした．

まず，熱的なタンパク質の構造安定性が変化していることが示唆されたため，タンパク質の熱安定性を定量的に評価できる示差走査熱量測定（differential scanning calorimetry：DSC）により，3種類のポリユビキチン（M1, K48, K63結合型）の2鎖長から6鎖長の熱力学的安定性を調べた^10）．興味深いことに，ポリユビキチン鎖は鎖長に依存して，熱力学的に構造不安定化することがわかった（図1a）．ただし，結合型には大きく依存せず，3種類すべてのユビキチン鎖で鎖長依存的な熱的不安定化が観察された（図1b）．一般的には，独立した立体構造を有するタンパク質のポリマーは，その重合度が増えるに従い，分子内で新たな静電相互作用や疎水性相互作用が生じるため，熱変性点が上昇することが知られている^11）．したがって，この鎖長依存的な構造不安定化はユビキチンのポリマー，ポリユビキチン鎖に特有の現象だと考えられる．

図1 鎖長依存的な熱力学的構造不安定化

（a）M1結合型ポリユビキチン鎖の熱変性曲線．（b）熱変性曲線における転移温度とポリユビキチン鎖の鎖長の相関．四角：K48結合型，三角：K63結合型，白丸：M1結合型ポリユビキチン鎖．黒丸：モノユビキチン．文献10により一部改変．

なぜ，ポリユビキチン鎖はモノユビキチンに比べ構造安定性が低下したのだろうか．この原因の一つに，ユビキチンどうしが共有結合で連結し，それぞれの運動性を制限し，分子形状や分子運動などの物理化学的性質に影響を与えることが考えられる．では，ユビキチン化タンパク質ではどうだろうか．細胞内では，ユビキチンはユビキチンどうしだけではなく，他のタンパク質に共有結合しているため，基質となるタンパク質も構造不安定化するのではないだろうか．事実，ユビキチン（8.6 kDa）は，リン酸基（97 Da）やアセチル基（43 Da）などの他の翻訳後修飾因子に比べ，分子量がきわめて大きく，基質タンパク質の構造安定性に影響を与えかねない．近年の分子動力学（molecular dynamics：MD）シミュレーションの研究で，ユビキチン化は基質タンパク質の構造安定性を低下させる可能性があると報告されている^12）．そこで筆者らは，実験的にユビキチン化の構造安定性への影響を検証した．基質タンパク質として，FK506-binding protein（FKBP12）とfatty acid binding protein 4（FABP4）を選び，トリプトファン蛍光測定により熱力学的な構造安定性を調べた^13）．

予想どおり，モノユビキチン化によりFKBP12もFABP4も構造不安定化することがわかった（図2a）．興味深いことに，ポリユビキチン化（ヘキサユビキチン結合）により基質タンパク質の構造安定性は，モノユビキチン化に比べ，より低下していた（図2a）．また，構造不安定化の程度は，ユビキチン化サイトの二次構造に依存性があり，β構造を形成している部位のユビキチン化は比較的大きい構造不安定化を引き起こすが，αヘリックスを形成している部位のユビキチン化は構造安定性にほとんど影響がなかった（図2b）．

図2 ユビキチン化による基質タンパク質の構造不安定化

（a）ユビキチン化タンパク質の熱変性転移温度の比較．（b）ジスルフィド結合を利用して作製したユビキチン化タンパク質の熱変性転移温度の比較．***p＜0.001, **p＜0.01, *p＜0.05, NSは有意差なし．FKBP12のK36, K48はβシート，K53はループ内にある．FABP4のK32はαヘリックス，K80はβシート，K121はループ内にある．（c）C53でモノユビキチン化させたFKBP12の¹⁵N緩和分散プロファイル．黒がFKBP12のみで，赤がユビキチン化FKBP12. Ub：ユビキチン．下図にユビキチン化部位（C53）ならびに¹⁵N緩和分散が観察されたアミノ酸をFKBP12の構造上に示した．文献13により一部改変．

次に，ユビキチン化による構造不安定化のメカニズムを解明すべく，溶液NMR法により，立体構造ならびにダイナミクスを調べた．¹H–¹⁵N相関スペクトルを測定したところ，ユビキチン化によって基質タンパク質の主鎖の化学シフト変化に顕著な差異は観察されず，立体構造は大きく変化していないことが示された．一方，マイクロ秒からミリ秒における主鎖の構造揺らぎを観測できる¹⁵N緩和分散実験を行った結果，ユビキチン化によって基質タンパク質はマイクロ秒からミリ秒において構造的に揺らいでいることがわかった（図2c）．これらの結果より，ユビキチン化は基質タンパク質の静的構造に大きな影響を及ぼさない一方，マイクロ秒からミリ秒の範囲のダイナミクスを変化させ，熱力学的不安化をもたらすと考えられる．

ユビキチンは連結することにより，鎖長依存的に構造安定性を低下させた．さらに，ポリユビキチン鎖は単量体とは異なる物性を獲得していた．それがタンパク質線維形成能である．熱変性により，ポリユビキチン鎖は100 nm程度のタンパク質線維を形成することがわかった（図3a）．また，撹拌などの微弱な流体力学的刺激を与えても同様のタンパク質線維を形成し，鎖長ならびに種類に依存して異なる線維形成速度が観察された（図3b）．熱変性温度が低くなるに従って，線維形成速度が増加しており，この結果は過去の報告にある，熱力学的安定性の低下は線維形成能が上昇するという実験結果に合致する^{14, 15）}．注目すべき点は，モノユビキチンはこれらの熱や流体力学的な刺激により線維を形成しない点である．

図3 ポリユビキチン鎖のアミロイド線維形成

（a）熱変性M1結合型ヘキサユビキチンの透過型電子顕微鏡像．（b）撹拌によるポリユビキチン鎖のアミロイド線維形成のプロファイル．（c）熱変性前後のヘキサユビキチンならびにアミロイドβ（1–40）線維の円二色性スペクトル．（d）熱変性モノユビキチンならびに熱変性ヘキサユビキチンのチオフラビン-T蛍光スペクトル．文献10により一部改変．

さらに，円二色性解析とチオフラビン-T蛍光解析によって，ポリユビキチン鎖が形成する線維はβ構造が連続した規則的な構造を有するアミロイド線維であることがわかった（図3cと3d）．アミロイド線維はアルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患やアミロイドーシス患者の病変部位に沈着しており，疾患発症や病状進行に関与している^16）．元来，ユビキチンは神経変性疾患で見つかる異常タンパク質凝集体（封入体）中に含まれていることがユビキチン抗体による免疫染色の実験によって示されている^17）．モノユビキチンは物理的・化学的に安定で可溶性が高いタンパク質であるため，ユビキチンが凝集体に含まれていることは長年の謎であった．ポリユビキチン鎖の鎖長依存的な構造不安定化とアミロイド線維形成能はユビキチン陽性のタンパク質凝集体形成を説明する一つの要因になるのではないかと考えられる．

どのようにしてポリユビキチン鎖は線維を形成するのか知るために，撹拌でポリユビキチン鎖が線維を形成することに着目し，筆者らは撹拌しながら原子分解能の構造情報を取得できるバイオレオロジーNMR法を新たに開発した^18）．バイオレオロジーNMR法は，NMR管（外管）の中心にガラス棒（内管）を挿入し，外管を回転させることで，静止した内管にはさまれた空間の溶液を撹拌するものである．この手法により，M1結合型のヘキサユビキチン（6鎖長のポリユビキチン鎖）を35 Hz（平均剪断速度680 s⁻¹）の回転数で撹拌したところ，白色沈殿ができ，透過型電子顕微鏡（TEM）で観察するとタンパク質線維が形成されていることがわかった（図4a）．さらに，チオフラビン-T蛍光解析によりアミロイド線維であることがわかった（図4b）．線維形成中にタンパク質の側鎖の化学的環境の変化を調べることのできる¹H–¹³C相関スペクトルを連続的に測定したところ，多くの部分では変化が観察されず，ポリユビキチン鎖が線維を形成する際，大きな構造変化が起こっていないことが示された．ポリユビキチン線維や，神経変性疾患で見つかる細胞内ユビキチン陽性タンパク質凝集体は，一般的なユビキチン抗体で染色できることから^17），ポリユビキチン鎖が形成する凝集体内のユビキチンは天然状態の静的構造から大きく変化していないことが示唆される．一方，プロリン側鎖やリシン側鎖などの二次構造要素をつなぐ比較的柔軟な領域で化学シフト変化が検出された（図4c）．この結果は，線維形成に伴って構造的に柔軟な領域にあるアミノ酸側鎖が互いに相互作用し，β構造が連続した規則的な構造を形成することを示唆する．特に，プロリン残基のシス–トランス異性化がアミロイド線維形成において重要な役割を担っていることが報告されているため^19），ポリユビキチン鎖のアミロイド線維形成においても，プロリン残基のシス–トランス異性化が深く関わっていることが考えられる．

図4 バイオレオロジーNMR法によるポリユビキチン線維形成過程の構造解析

（a）撹拌後のM1結合型ヘキサユビキチン凝集体の透過型電子顕微鏡像．（b）撹拌前後のヘキサユビキチンのチオフラビン-T蛍光スペクトル変化．（c）撹拌前後での¹H–¹³C相関スペクトル変化（上）．変化のあったアミノ酸をモノユビキチンの構造上にマッピングした（下）．文献18により一部改変．

さらに，筆者らは試験管で観察したポリユビキチン鎖の鎖長依存的な凝集体形成が細胞内でも観測できるのか検証した．蛍光タンパク質EGFPをC末端に結合させたモノユビキチンあるいはポリユビキチン鎖（ヘキサユビキチン）をマウス胎仔線維芽細胞（MEF）内で過剰発現させ，凝集体を形成するか調べた．モノユビキチンを発現させた細胞では顕著な凝集体は確認できず，細胞質にほぼ一様に分布していることがわかった（図5a）．一方，ポリユビキチン鎖を発現させた細胞では，細胞質内で2 µm程度の凝集体の形成が観察された^10）．これらの結果は，試験管内で観察したポリユビキチン鎖の熱力学的な構造不安定化が，細胞内でも引き起こされていることを示唆する．加えて，ポリユビキチン凝集体には選択的オートファジー（アグリファジー）に関連するタンパク質p62（およびリン酸化p62）とLC3が共局在していることがわかった（図5a）．したがって，細胞質内で形成されたポリユビキチン凝集体は選択的オートファジーによって分解される可能性がある．

図5 細胞内ポリユビキチン凝集体の選択的オートファジーによる分解

（a）C末端にEGFPを結合させたモノユビキチン（上段）とヘキサユビキチン（下段）を過剰発現させたマウス胎仔線維芽細胞（MEF）．上部に免疫染色で用いた抗体を示す．（b）ドキシサイクリン存在下で24時間ヘキサユビキチンを過剰発現させたMEF細胞と，その後24時間ドキシサイクリン非存在下で培養したMEF細胞の細胞抽出液のウェスタンブロッティング．左に用いた抗体を示す．MEF細胞は野生型（Atg7^＋/＋）とオートファジー不全MEF細胞（Atg7^−/−）を用いた．（c）オートファジー不全MEF細胞内に野生型Atg7または不活性変異体Atg7 C567Sを発現させた条件下でヘキサユビキチンを一過的に過剰発現させた細胞の細胞抽出液のウェスタンブロッティング．（b）と同様にドキシサイクリン存在下でヘキサユビキチンを発現させ，その後ドキシサイクリン非存在下で培養した．左に用いた抗体を示す．文献10により一部改変．

そこで，その可能性を検証するため，まず，野生型MEF細胞内で一過的に（ドキシサイクリン依存的に）ポリユビキチン鎖（ヘキサユビキチンEGFP）を発現させ，細胞質内に凝集体を形成させた．その後，細胞をドキシサイクリン非存在下で培養することで，ポリユビキチン鎖の発現を抑制した条件にし，ポリユビキチン鎖凝集体の存在量を追跡した．すると，24時間ほどでほぼすべてのポリユビキチン凝集体は分解されることがわかった（図5b）．また，アグリファジーで観察されるp62ならびにリン酸化p62の分解も観察できた^20）（図5b）．一方，オートファジー機能を不全にしたMEF細胞内（Atg7^−/−）で同様の実験を行うと，野生型とは対照的にポリユビキチン凝集体はほとんど分解されず，p62ならびにリン酸化p62の分解もみられなかった（図5b）．また，オートファジー機能不全細胞内でAtg7野生型を発現した場合，ポリユビキチン凝集体は野生型MEF細胞内と同様に分解されるが，不活性変異体Atg7 C567S^21）を発現した場合は，凝集体は細胞内に蓄積したままであった（図5c）．これらの結果は，細胞内ポリユビキチン凝集体がオートファジーにより特異的に分解されることを示す．これはオートファジー関連タンパク質がこれらの凝集体（固体もしくは相分離体）を識別している可能性を示唆し，構造生物学的観点からも興味深い結果である．

ユビキチンは1978年にエネルギー依存的タンパク質分解への関与が報告されて以来，広範で多様な生物学的役割が明らかにされてきた．一つのタンパク質がここまで多様な機能をつかさどることは稀有であろう．そこで重要になるユビキチンの特徴が，その形態をさまざまに変えることである．多種類のポリマー形成，リン酸化^22–24），アセチル化^25）といった，本来モノユビキチンでは発揮されない機能を形態変化によって獲得することができる．

そして，本研究で示したように，ユビキチンは鎖を長くすることによって線維形成能を獲得し，分解すべき基質を凝集体として隔離し（細胞毒性の低い固相に落とし），選択的オートファジーによって一括に分解するという機能があるのかもしれない．老化やストレスに伴い，オートファジー活性が低下することが報告されており^{26, 27）}，その場合，凝集体は分解されず細胞内に蓄積し始めてしまう．特に，神経細胞においては，この凝集体蓄積は細胞の機能不全や細胞死に直結してしまうのかもしれない．本研究で明らかにしたポリユビキチン鎖の鎖長依存的な物性は，神経変性疾患におけるユビキチン陽性封入体の形成を理解する上で重要な証拠であり，今後，ポリユビキチン凝集体の形成機構，凝集体と疾患との関係の解明が期待される．