生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

軟体動物の酸素運搬タンパク質であるヘモシアニンは，銅イオンを配位し相同性の高い機能ドメイン（約50 kDa, functional unit，以下FUと表記）の繰り返しからなる350～450 kDaからなるポリペプチド鎖の多量体である．イカやタコの頭足類のヘモシアニンは10量体のシリンダー構造をとり，その大きさは全体で約3.5～4.5 MDaにも及ぶ．巻貝などの腹足類のヘモシアニンは2ないし3個以上の10量体がさらに積み重なった13.5 MDaにもなる巨大なシリンダー状の複合体を形成する．これらの構造的特徴から，軟体動物のヘモシアニンは以下の四つのタイプに分類される．

図1 TpHの3D構造

（a） C₅対称として精密化後の立体構造，（b）回転対称のないC₁対称として計算したab initio初期構造．（c）C₁対称として計算した精密化後の立体構造．黄色でFU-g，シアンでFU-d*を示す．International Union of Crystallographyより許可を得て引用^9）．

1. Type 1：巻貝の一種であるキーホールリンペット由来ヘモシアニン（KHL）に代表される20量体のヘモシアニン．
2. Type 2：30量体の巨大ヘモシアニン．
3. Type 3：タコヘモシアニンに代表される10量体のヘモシアニン．
4. Type 4：イカヘモシアニンに代表される10量体のヘモシアニン．

このようなメガダルトンオーダーのヘモシアニンは単に巨大なタンパク質として知られているだけでなく，KHLは抗体作製時のキャリアタンパク質や，免疫賦活剤や抗がん治療併用剤としても利用されている^1）．さらなる応用へ向けて，これまでヘモシアニンの生理機能の詳細な分析やヘモシアニンの構造解析が行われてきた．ヘモシアニンは非常に大きなタンパク質会合体であるため，これまで主に電子顕微鏡を用いてその構造が決定され^2–4），X線結晶構造解析によるヘモシアニンの構造解析は個々のFUに対して行われてきた^{5, 6）}．その結果，KHL（Type 1），メガヘモシアニン（Type 2），さらに，オウムガイ（Type 3）のヘモシアニンの構造解析に成功し，それぞれN末端側の6個のFU（FU-a, b, c, d, e, f）がシリンダー構造のD₅対称な外壁領域を形成し，残りのC末端側FUの個数により内部領域の構造にはいくつかのパターンが存在することが明らかになっている^7）．C末端側FUのドメイン数の変化に伴う内部構造の違いはヘモシアニンの全体構造を大きく変えることなく，それぞれの種の生息環境に適応した酸素運搬能を獲得するために進化した結果であると考えられている．

上述したヘモシアニンとは異なり，外壁領域を構成するドメインの一つであるFU-dが遺伝子重複により複製され，FU-d*ドメインを獲得したスルメイカ（Todarodes pacificus）由来ヘモシアニン（TpH）は，特異なドメイン構成（FU-a, b, c, d, d*, e, f, g）を有し，Type 4のヘモシアニンに分類される．TpHは電子顕微鏡ではなくX線結晶構造解析によりその全体構造が決定された^8）．X線結晶構造解析からは，FU-d*と-gが内部領域に存在することがわかった．TpHは他のヘモシアニンと同様のD₅対称（z軸回りに72°ずつの回転対称であるC₅対称に加え，x軸に対し180°の回転対称であるC₂対称も持つ）の外壁領域に加え，FU-d*とFU-gがそれぞれ内部領域の下部と上部領域にC₅対称な配置をとり（C_n対称とは360°÷nずつの回転対称をもつ），全体構造もC₅対称性の分子構造を形成していることが示唆された．また，結晶中ではシリンダー型の分子が50％の割合で上下反転して積み重なって結晶化していたため，疑似のD₅対称を示す電子密度が観測された．その結果，内部領域では上向きの分子由来と下向きの分子由来の電子密度が複雑に重なりあっており，詳細な構造を決定することができなかった．そこで，我々はクライオ電子顕微鏡（Cryo-EM）を用いた単粒子構造解析により4.2 Å分解能での3.8 MDaのTpHの会合体構造を決定した^9）．本構造解析により，TpHは外壁領域のD₅対称とは異なり，非対称な内部領域を持つことが明らかになった．本稿では，ヘモシアニンの全体構造・会合様式や立体構造から見たヘモシアニンの進化における形態変化，そして，X線結晶構造解析により疑似のD₅対称性が観察された理由について紹介する．

図2 TpHのシリンダー状複合体構造を構成する10個のプロトマーと各FUの配置

（a） TpHの3次元構造を横方向，上方向，下方向から見た構造．（b）TpHを構成する10個のプロトマーと5組のプロトマー二量体，内部領域に存在するFU-g二量体の関係．（c）TpHの内部領域についての概略図．各プロトマーは異なる色で表示した．各図中のプロトマーの配色は同一である．International Union of Crystallographyより許可を得て引用^9）．

スルメイカから採取，精製して氷包埋したTpHはFALCON II電子直接検出器を装備したTITAN KRIOS（FEI, 300 kV）で測定した．負染色電子顕微鏡画像と既知結晶構造の特徴から，TpHがC₅対称を持つ分子であると仮定し，Cryo-EM画像からTpHの三次元初期モデルを構築した．しかし，この初期モデル構造はX線結晶構造解析の結果と同様に，内部領域には上向きのFUと下向きのFUが共に50％の存在率で上下反転して重なっていたため，上下対称な合計40分子のFUが観測され（本来は20個のFUのみ），また，内部構造は不明瞭であった（図1a）．この結果から，C₅対称として解析した単粒子構造は外壁領域のD₅対称に引きずられた不正確な立体構造であることが示された．

対称性を利用して三次元初期モデルを計算すると，疑似的な対称性を持つ不正確な立体構造へと誘導されてしまうことがわかったため，対称性を考慮せず回転対称を持たないC₁対称としてTpHの初期モデル構造を作成した．その結果，D₅対称の外壁領域と非対称な20個のFUからなる内部領域が計算された（図1b）．その後，内部領域をマスクして外壁領域だけを取り出し，また，それとは逆に外壁領域をマスクして内部領域を取り出して個別に精密化し，さらに，得られたD₅対称の外壁領域と非対称の内部領域の構造を統合してさらなる精密化を行うことで，外壁領域と内部領域で異なる対称性を持つ特異な分子特性を持つTpHの立体構造を決定することができた．

Cryo-EMにより明らかになったTpHの立体構造は，典型的なD₅対称を持つ外壁領域と非対称なFUの配置を持つ内部領域から形成されていた．外壁領域に比べ内部領域の分解能は低くde novoモデル構築は困難であったため，rigid bodyによりモデルを構築した．TpHの結晶構造のうち，外壁領域に存在する60個のFU（FU-a-b-c-d, e-fが10個のプロトマー分存在）はCryo-EMの単粒子構造解析で得られた電子密度に非常によく収まった．

次に，結晶構造のFU-gとFU-dを鋳型として内部領域に位置するFU-gとFU-d*のモデルを構築した．内部領域には合計20個の電子密度が存在していた．外壁領域と内部ドメインを連結するリンカー領域（FU-dとFU-d*の間，FU-d*とFU-eの間，およびFU-fとFU-g間をつなぐリンカー領域）の電子密度は確認できなかったため，10量体形成時に二量体を形成することが知られているFU-gについて，はじめにその位置を同定した．明らかになった構造中には5個のFU二量体の電子密度が観測され，これらをFu-gの二量体と断定した．5個のFU-g二量体の他に，10個のFUの電子密度が存在し，これらをFU-d*ドメインとして帰属した．その後，ポリペプチド鎖のつながりを確定するために，FU-dのC末端とFU-d*のN末端，FU-d*のC末端とFU-eのN末端，FU-fのC末端とFU-gのN末端の距離を計測し，最終的に10個のプロトマーすべてのFUの構造を決定した（図2）．

既知のヘモシアニンとTpHの構造を比較すると，既知のヘモシアニンでは内部領域に位置するFU-g二量体は上部領域にのみC₅対称に存在する．しかし，TpHの構造では，五つのFU-g二量体の配置は，上-下-上-下-上部の順にジグザクに配列していた．その結果，一つ目と隣接する五つ目のFU-g二量体はともに上部に位置するために対称性がなく，FU-gは非対称性な配置となっていた．一方，FU-d*は二量体構造をとることなくFU-gとは反対側の領域に存在していた（図2）．

配列を帰属した個々のプロトマーの構造を，対称性の破れを生じたプロトマーを9および10として時計回りに命名し，10個のプロトマー構造をそれぞれ比較した．その結果，FU-d*とFU-gの配置の違いにより，10個のプロトマーは4種類のコンフォマーに分類された（図3）．プロトマー1, 2, 5, 6はコンフォマー1に，プロトマー3, 4, 7, 8はコンフォマー2に分類され，さらに，対称性の破れが生じるプロトマー9とプロトマー10は二つのコンフォマーとは異なるコンフォマー3と4に分類された．10量体に会合する際は，コンフォマー1およびコンフォマー2はそれぞれ2回対称のホモ二量体を形成し，一方，コンフォマー3とコンフォマー4はヘテロ二量体を形成していた（図2）．このようなコンフォマー二量体が，（コンフォーマー1ホモ二量体）-（コンフォマー2ホモ二量体）-（コンフォーマー1ホモ二量体）-（コンフォマー2ホモ二量体）-（コンフォマー3とコンフォマー4のヘテロ二量体）の順で会合して，シリンダー状の10量体構造が形成されていた．

図3 プロトマーの立体構造の特徴

各プロトマーをコンフォメーションで分類した．FU-gをシアン，FU-d*を黄色で示す．International Union of Crystallographyより許可を得て引用^9）．

FUのドメイン構成の特徴から，Type 4ヘモシアニンであるTpHはType 3ヘモシアニンのFU-dが複製されてFU-d*を獲得して進化したと考えられる．今回，単粒子構造解析によって，これまで不明であったFU-d*を持つTpHの内部領域を含むTpHの全体構造の解明に成功したことで，進化に伴うヘモシアニンの形態変化モデルを提唱することができた．以下に我々が提唱した形態変化を説明する．

Type 3ヘモシアニンは二つの異なるコンフォマーがヘテロ二量体となり，このヘテロ二量体が五つ連結したC₅対称の構造を形成する［図4（i）］．進化によってFU-d*を獲得したTpHもType 3と同様なヘテロ二量体を形成しようとする．しかし，FU-d*同士の立体障害により二つのプロトマーに解離し，FU-d*とFU-gが極側に位置するコンフォマー4と，FU-d*とFU-gが赤道側に位置するコンフォマー3を生じる［図4（ii）］．FU-d*はフレキシブルなリンカーによってFU-dおよびFU-eとつながっているためFU-d*の位置をスワップさせることが可能となる．その結果，FU-d*の位置をスワップさせることでコンフォマー4からコンフォマー1が，コンフォマー3からコンフォマー2が生成され，同一コンフォマーのホモ二量体が形成される［図4（iii）］．コンフォマー1二量体とコンフォマー2二量体はそれぞれのFU-g同士がFU-g二量体を形成することで交互に配列する．さらに，コンフォマー1-2-1-2の順で配列した四つのコンフォマー二量体の両端のFU-gは，Type 3ヘモシアニンと同じ構造的特徴を持つコンフォマー3および4のFU-gと結合してFU-g二量体を形成する［図4（iv）］．その結果，シリンダー状の構造を形成し［図4（v）］，コンフォマー3中のFU-d*が立体障害を避ける位置に配置することでコンフォマー3と4がヘテロ二量体を形成することで，全体構造がシリンダー状であるが内部構造は非対称なTpHの構造へと進化したと考えられる．

図4 Type 3からType 4への形態変化のモデル

International Union of Crystallographyより許可を得て引用^9）．

1節で述べたようにX線結晶構造解析ではTpHの外壁領域の詳細な構造を決定できた^8）．しかし，内部構造については各10個のFU-d*とFU-g，合計20個しか存在しないにもかかわらず，D₅対称に配置した40個のFUが観測された．また，結晶構造を詳細に確認すると，内部構造はクリスタルパッキングには関与せず，隣接分子間同士は外壁領域のみで接していた．このことから，X線結晶構造ではC₅対称のTpHが上下方向にひっくり返った分子が50％の確率でランダムにパッキングされ，結果として，D₅対称の疑似の平均構造が観測されたと結論づけられた．

一方，単粒子構造解析からは，TpHは，D₅対称な外壁領域と，非対称な内部構造により構成されていることがわかった．このような構造的特徴を持つTpHがストロー状に上下の別なく積み重なって結晶化した結果，72°ずつ回転した五つの異なる向きのTpHと，さらに，上下反対向きに配向した，合計10種類の異なる向きのTpHがランダムにパッキングし，結果的に疑似のD₅対称を与えたために，本来の非対称な内部構造を持つ分子として結晶構造が解析できなかったことが判明した（図5）．

図5 C₁対称を示すTpHの結晶化におけるパッキングによって，疑似のD₅対称を持つ結晶構造が生まれる理由

International Union of Crystallographyより許可を得て引用^9）．