生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

細胞はさまざまなタンパク質を発現し，複雑な生命機能を維持している．ほとんどのタンパク質は，翻訳後修飾による機能制御を受けている．糖鎖修飾は，リン酸化と並び，細胞内で最も豊富に存在する翻訳後修飾の一つであり，タンパク質の機能，品質管理や細胞内輸送を制御する．タンパク質のセリンおよびトレオニン残基に結合するO結合型糖鎖修飾の一つであるO-linked N-acetylglucosamine（O-GlcNAc）は，以前からよく知られており，細胞質，ミトコンドリアおよび核のみに存在すると考えられてきた．しかし，今から約10年前に，細胞表面に発現するNOTCH受容体にO-GlcNAcが見つかり，細胞外O-GlcNAcの存在が明らかになった．細胞外O-GlcNAcは，上皮成長因子（epidermal growth factor：EGF）様ドメインを含む糖タンパク質に限定されたユニークな修飾である．この修飾は，小胞体の内腔に局在するEGFドメイン特異的O-GlcNAc転移酵素（EGF domain-specific O-linked N-acetylglucosamine transferase：EOGT）によって触媒される．EOGTの変異は，ヒト先天性疾患のアダムス・オリバー症候群（Adams-Oliver syndrome：AOS）の患者で報告され，本疾患の原因遺伝子の一つである．本稿では，本研究室の最近の知見を含めて，細胞外O-GlcNAcの構造と機能について紹介する．

細胞内O-GlcNAcは，1984年にHartによって発見された^1）．O-GlcNAc転移酵素（O-linked N-acetylglucosamine transferase：OGT）の細胞内局在から，核，細胞質およびミトコンドリアに存在するタンパク質がO-GlcNAcの修飾を受けると考えられ，実際，これらの細胞内小器官のタンパク質にO-GlcNAcが検出されてきた．しかし，2008年に岡島らが，ショウジョウバエNOTCH受容体の細胞外領域にある第20番目の上皮成長因子（EGF）ドメイン（EGF20）をショウジョウバエ胚由来の培養細胞（S2細胞）に発現させて解析した際，O-GlcNAcの修飾を見つけた^2）．その後，哺乳動物細胞のNOTCH1受容体にもO-GlcNAcの修飾が同定された^3）．この細胞外O-GlcNAc^4）は，OGTとは異なる，小胞体（ER）に局在するEGFドメイン特異的O-GlcNAc転移酵素（EOGT）によって付加されることが岡島らによって報告された^5）．EGF上の細胞外O-GlcNAcは，細胞内O-GlcNAcと同様に抗O-GlcNAc抗体（CTD 110.6など）と反応し^6），また，β-ヘキソサミニダーゼ消化によって除去される^2）．

細胞外O-GlcNAcを持つタンパク質は，今までに10種類以上報告されている．哺乳動物細胞では，NOTCH1受容体に加えて，NOTCH2受容体，トロンボスポンジン-1（TSP-1），HSPG2（Perlecan），neural EGFL like 1（NELL1），laminin subunit alpha 5（LAMA5），peptidase domain containing associated with muscle regeneration 1（PAMR1）などがある．ショウジョウバエでは，細胞外マトリックスの成分の一つであるDumpyがある．共通点は，これらタンパク質の細胞外領域にはEGFドメインがあり，EGFドメイン特異的にO-GlcNAcで修飾されることである．

EOGTは，約530アミノ酸からなり，糖転移反応に必須のDXDモチーフがある^3）（図1A）．EOGTは，膜貫通領域を持たないが，C末端にKDEL様の配列を持ち，小胞体に局在する^3）．これは，EGFドメインを修飾する他の酵素と共通な性質である．

図1 EOGTによるO-GlcNAc修飾

（A） EOGTの構造（文献7より引用）．（B） EOGTの基質となるEGFドメインとO-GlcNAc修飾の位置（Takeuchi, H. & Haltiwanger, R.S. （2010） Semin Cell Dev Biol. 21, 638–645より引用）．（C） O-GlcNAc修飾の構造．

これまでの研究では，マウスEOGTが主に解析されてきた．ヒトとマウスのEOGTのアミノ酸配列は，約90％の相同性があり，主要な配列は保存されている．EOGTには，N型糖鎖修飾の候補部位が3か所あるが，このうちの2か所（N263, N354）に高マンノース型のN型糖鎖修飾を受けることが，最近，本研究室のDidarul Alamらによって示された^7）．これらのN型糖鎖を欠損すると，NOTCH1受容体のO-GlcNAcの修飾率は低下する^7）．しかし，意外なことに，in vitro酵素アッセイではEOGTの酵素活性は低下せず，N型糖鎖の欠損はEOGTの酵素活性に影響しないことが判明した^7）．一方で，N型糖鎖の付加を阻害するツニカマイシンで処理したhuman embryonic kidney（HEK）293T細胞やHeLa細胞では，EOGTの小胞体内での局在が変化し，核周辺と比べて小胞体辺縁のEOGTの分布率が低下した^7）．よって，EOGTのN型糖鎖は，小胞体辺縁への局在に必要であることが明らかになった^7）．

EOGTの基質となるEGFドメインは，30～40アミノ酸からなり，六つのシステインを含む．これらのシステイン残基が三つのジスルフィド結合を形成して，EGFドメインは三次元構造を構築する．EOGTは，EGFドメインの5番目と6番目のシステインの間にあるセリン／トレオニン残基［C⁵XXXX（T/S）X_2-3C⁶］にGlcNAcを転移する^8）（図1B）．O-GlcNAc付加の正確な共通配列の確立は，さらなる研究が必要である．

EGFリピートを多数持つタンパク質は，複数のO-GlcNAcの修飾を受けることが多い．O-GlcNAcの糖プロテオーム解析は，S2細胞に発現させたショウジョウバエNOTCH受容体を用いて初めてなされた^8）．NOTCH受容体は，I型膜貫通タンパク質で，その細胞外領域に36個のEGFリピートがある．五つのEGFドメイン（EGF4, EGF11, EGF12, EGF14, EGF20）は，高度にO-GlcNAcで修飾されていた．これらのO-GlcNAcは，単糖として検出される^{2, 8）}．

一方，哺乳類のO-GlcNAcも単糖と考えられていた．しかし，O-GlcNAc以外のO型糖鎖であるO-フコースは，ゴルジ装置でGlcNAc転移酵素（Fringe）によってGlcNAcが付加されて伸長し，さらにβ1,4-ガラクトースとα2,3-シアル酸で修飾されることが知られている．よって，O-GlcNAcもガラクトースとシアル酸で伸長される可能性があった（図1C）．一昨年，HEK293T細胞から精製したマウスNOTCH1受容体のEGFドメイン領域の質量分析により，マウスNOTCH1受容体上のO-GlcNAcの修飾部位とその詳細な構造の大部分が明らかにされた^9）（図2A）．O-GlcNAcは11個のEGFドメインに検出された^9）．興味深いことに，修飾比率はさまざまで，EGF14, EGF21およびEGF23は約90％の修飾比率であったが，EGF11とEGF28は約10％未満とごくわずかであった^9）．O-GlcNAcの伸長構造（図1C）も存在し，EGF2で50％ほどの割合で検出され，最も比率が大きかった^9）．EGF14の修飾は単糖であり，EGF21とEGF23の修飾は80％が単糖で20％が伸長されていた^9）．O-GlcNAcの伸長の有無がタンパク質の機能や構造にどのように影響するかはわかっておらず，今後の課題である．

図2 NOTCH1受容体とO型糖鎖修飾

（A）マウスNOTCH1受容体のEGFリピート上のO型糖鎖修飾（文献9より引用）．（B） NOTCH1受容体の糖鎖付加の経路とNOTCHシグナル経路．NICD：Notch intracellular domain, EOGT：O-GlcNAc転移酵素，POFUT1：O-フコース転移酵素，POGLUT1：O-グルコース転移酵素，ADAM：a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif family metalloprotease. 赤色，青色および緑色の○は糖鎖を表す．

NOTCH受容体は，O-GlcNAc以外にO-フコースとO-グルコースの修飾も多数受ける（図1B，図2A）．O-フコースはEGFドメインの3番目のシステインの直前にあるセリン／トレオニン残基に付加され，O-グルコースはEGFドメインの1番目と2番目のシステインの間にあるセリン残基に付加される（図1B）．これらO型糖鎖の組合わせは，各EGFによってさまざまである．O-フコースとO-グルコースは，正しくフォールディングされたEGFに付加されることが知られている^10）．それぞれの修飾は，一つのEGFに含まれる三つのジスルフィド架橋の中で前半の二つの架橋を補強する位置にあり（図1B），実際にEGFの立体構造を安定化することが報告されている^10）．一方，O-GlcNAcの修飾は，前半の二つの架橋とは独立した後半にある（図1B）．O-フコースやO-グルコースの欠損はNOTCH1受容体の細胞表面の発現量の大幅な低下を引き起こすが，O-GlcNAcの欠損では低下しない．これらのことから，O-GlcNAcは，EGF構造の安定化にあまり影響しないと考えられた．しかし，最近，本研究室の小川・田嶌らによって，O-GlcNAcがEGFの立体構造を安定化することが新しく示された^11）．NOTCH1受容体の一部のEGF（EGF26～EGF33）のすべてのO型糖鎖の修飾部位に変異を導入すると，NOTCH1受容体は細胞表面に発現しないが，O-GlcNAc修飾の回復で発現する^11）．さらに，ショウジョウバエのNOTCH受容体のEGF20にdithiothreitol（DTT）でフォールディングの破壊を誘導した実験では，O-GlcNAcが付加されていると安定性が増して，誘導に必要なDTTの処理濃度が上昇しDTTへの抵抗性が増した^11）．また，西村らによって，NOTCH1受容体のEGF10とEGF11の間のつなぎ目の柔軟性と硬直性は，EGF10のO-GlcNAcで制御されることが示された^12）．このように，O-GlcNAcは，EGF構造の不安定性を補強する．

NOTCH1受容体は，小胞体で合成されて，O-フコース，O-グルコースおよびO-GlcNAc修飾を受けた後，ゴルジ体に運ばれて，O-GlcNAc修飾がさらに伸長される（図2B）．細胞表面に到達したNOTCH受容体は，隣接する細胞に発現するリガンドと結合する．そして，a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif family metalloprotease 10, 17（ADAM10, ADAM17）によって切断され，さらにγ-セクレターゼによる切断を受けてNotch intracellular domain（NICD）が細胞膜から遊離する．NICDは，核に運ばれ，RBPJなどのターゲット遺伝子に作用する．

NOTCHシグナル伝達因子の遺伝子に異常が見つかる疾患の一つに，ヒト先天性疾患であるアダムス・オリバー症候群（AOS）がある．AOSは，四肢の末端横肢欠損（四肢の遠位構造の欠如または低形成）と，頭皮および頭蓋骨の欠損を特徴とする先天性切片形成不全を特徴とする^13）．AOSは，しばしば血管異常および心臓障害を伴う^13）．病理メカニズムは，いまだ解明されていない．AOS患者のゲノム配列の解析から，変異が見つかって原因遺伝子として同定されたものに，アクチン-細胞骨格調節因子（ARHGAP31, DOCK6）とNOTCHシグナル伝達因子（NOTCH1, DLL4, RBPJ, EOGT）がある．

AOS患者で検出されるEOGTのアミノ酸の変異は，W206S, R377Q, 359Dfs*28などがある．これらの変異は，酵素活性を低下させる^14）．W206S変異は，EOGTのミスフォールディングを誘導し，細胞内局在の変化とユビキチン-プロテアソームシステムを介した分解が起こる^14）．R377Q変異は，UDP-GlcNAcとの結合能が低下するが，正常なタンパク質の安定性と局在を示す^14）．R377は，EOGTとドナー基質との結合を媒介するようである．

Eogt欠損マウスは，AOS患者とは異なり，肉眼的な異常は認められない^15）．この理由は明らかではない．ヒトとマウスでは，四肢や頭皮の形態が大きく異なることから，表現型に関連するNOTCHシグナル依存的な発生プログラムが両者で異なることが考えられる．一方，Eogt変異マウスは，網膜の血管新生に障害が認められ，血管の分岐と血管前面での糸状突起の形成の増加が起こる^15）．EOGTは，血管内皮細胞で高発現している．Eogt欠損マウスでは，血漿フィブリノーゲンの局所的な滲出も観察される．これらの表現型は，Notch1およびRbpjヘテロ接合マウスの表現型と類似する．Rbpjは，Notchシグナル伝達経路の下流の遺伝子である（図2B）．Eogt^−/− Notch1^+/−またはEogt^−/− Rbpj^+/−の二重変異マウスで表現型が増強されることから，血管内皮細胞におけるNotchシグナル伝達の正確な制御にEOGTは必要である^15）．Eogt欠損でO-GlcNAcが付加されなくても，NOTCH1受容体の細胞表面の発現量は影響されない^{11, 15）}．EOGTによってO-GlcNAcがNOTCH1受容体に付加されると，NOTCHリガンドの一つであるDLL4とNOTCH1受容体の結合が増強される^15）．NOTCH1受容体のEGF2, EGF10, EGF17, EGF20のO-GlcNAcの修飾部位をアラニンに置換すると，DLL4-NOTCH1結合の増強効果は消失する^15）．この４つのドメインのうち，EGF17は質量分析法によるO-GlcNAcの検出に成功していないが，EGF2，EGF10及びEGF20はO-GlcNAc糖鎖が確認されている^9）。これらのドメインの多くは，O-GlcNAc糖鎖の伸長を受けており，このことがDLL4との結合を増強することに寄与する可能性が考えられる．

これまでの研究で，細胞外O-GlcNAcは，NOTCHシグナル経路を介する動物の発生過程や細胞外マトリックスの形成に重要であることが示されていたが，ようやく最近になって，O-GlcNAc糖鎖の存在を直接的に検出することができるようになった．今後，さまざまな組織におけるO-GlcNAc糖鎖の発現様式の多様性による分子機能の変化についての理解が急速に進み，さまざまな生命現象におけるO-GlcNAc糖鎖の分子機能がひもとかれることが期待される．