生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

リボソーム上でのタンパク質の生合成に用いられている22種のアミノ酸に加え，生物はさまざまな非タンパク質性アミノ酸を生合成している．植物では，特にマメ科やイネ科で植食性昆虫の食害や他の植物の生長を抑えるための化学的防御の手段として用いられている^1）．L-canavanine［（S）-2-amino-4-guanidinooxybutyric acid］はタチナタマメの豆から同定されたL-アルギニンの類縁体である．L-canavanineは昆虫をはじめ，哺乳類，植物，カビなどさまざまな生物に毒性を示す．L-アルギニンの代謝をかく乱することで，毒性を示すと考えられる^{2, 3）}．ある種の昆虫は高感度にL-canavanineを検出し，これを避ける行動を示す^4）．さらに，豆中のL-canavanineの重量は乾燥重量の13％にも達し^5），豆にとっての窒素リサイクルにも役立っているという点も興味深い^6）．γ-aminobutyric acid（GABA）は原核，真核生物に広く見いだされる非タンパク質性アミノ酸である．植物では，さまざまな環境ストレスや昆虫の食害によって誘導され^{7, 8）}，グルタミン酸カルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase：GAD）により生合成される^{9, 10）}．昆虫に対しては，神経の興奮伝達システムに抑制機能を持つGABA作動性塩素チャネルを阻害し，食害した昆虫のパフォーマンスを落とすと考えられている^11）．L-チロシンの類縁体であるmimosine［（2S）-2-amino-3-（3-hydroxy-4-oxopyridin-1（4H）-yl）propanoic acid］はいくつかのマメ科植物に見いだされ^12），昆虫に対する生育阻害^{13, 14）}，イネなど植物に対する毒性^15），ネズミの致死的な奇形^16）やヒツジの羊毛の減少^17）などを引き起こす．イネ科オオウシノケグサ（ウシノケグサ属）やトウダイグサ科マートルトウダイグサ（トウダイグサ属）は根から，L-チロシンの異性体であるm-チロシンを分泌する．m-チロシンは多くの植物に対して毒性を示すので，生態学的にはアレロパシー活性物質として機能していると示唆される．興味深いことに，オオウシノケグサとマートルトウダイグサは異なる合成経路を持っており，進化の過程で独立にm-チロシンを獲得したと考えられている^18–20）．

β-アミノ酸とは，アミノ基がβ炭素にシフトした非タンパク質性アミノ酸である．非リボソームペプチド，細菌由来の抗生物質，抗がん剤の構成成分として報告されてはいるが^21），生物学的には比較的珍しい成分である．具体的に，β-フェニルアラニンとβ-チロシンを取り上げてみよう．β-フェニルアラニンは，グラム陰性菌の一種Pantoea agglomerans由来の抗生物質andrimid^22）およびイチイ科イチイ属のタイヘイヨウイチイの樹皮から単離同定された抗がん物質paclitaxel（taxol）^23）の構成成分として知られている．ヨーロッパイチイの葉に大量に含まれる成分10-deacetylbaccatinがpaclitaxelの合成中間体として用いられている．β-チロシンは，Bacillus brevis由来のedeine AおよびB^24），Streptomyces globisporus由来の抗生物質C-1027^25），Myxococcus fulvus由来のmyxovalargin^26），Chondromyces crocatus由来のchondramide C^27）などの構成成分である（図1）．詳細は後述する．

図1 β-フェニルアラニンおよびβ-チロシンを含む天然物の例^30）

β-アミノ酸を丸で囲んで示す．

著者らは，イネの新規な代謝物の探索とその生合成経路の解明を試みた．しかしながら，ゲノム解析も終了したイネを扱って，この時代にイネの新規な代謝物を探し出し，その生合成経路を明らかにすることは可能だろうか？　そのためには何らかの工夫が必要と考え，著者らは次の三点にポイントを置いた．それは，①官能基の修飾を経て初めてクロマトグラフィーで解析可能となる化合物をターゲットとすること，②ターゲットとする化合物はエリシターにより生合成が活性化されること，そして③遺伝的解析が迅速にできるように，イネの品種を選ぶことである．結果的にいえば，この三つのポイントの設定が功を奏した．著者らは，①からターゲットを非タンパク質性アミノ酸とした．非タンパク質性アミノ酸を網羅的に解析するには，誘導体化により極性を低下させてODSカラムに吸着しやすくしたものをLC/MSで分析する，あるいは誘導体化により揮発性を増してGC/MS分析するのが定法である．すなわち，分析にはワンステップが必要な化合物群である．これなら，見逃されている代謝物があるかもしれない．②についてはエリシター処理として植物の傷害応答に関わるジャスモン酸を用いた．誘導性代謝物に注目することで新規な代謝物・代謝経路の発見につながりやすいこと，ゲノムが解読されているイネではジャスモン酸処理で活性化される遺伝子が網羅的に調べられていることも最終的な遺伝子の絞り込みには有用な情報になると期待した．さらに③から，ジャポニカ品種の日本晴とインディカ品種のカサラスの差に着目した．これは，日本晴とカサラスの染色体断片置換系統（chromosome segment substitution line：CSSL）が利用できるからである．染色体断片置換系統とは，染色体の一部のみが片親（カサラス）由来で，残りの部分がすべてもう一方の親（日本晴）となった系統である．すなわち，日本晴の特定の染色体上のある領域がカサラスに置換された系統では，欠損した遺伝子上に代謝物の生合成に関与する遺伝子があれば，注目した代謝物が消失すると期待できる．CSSLsは戻し交雑とDNAマーカー選抜を駆使することで作出される．多数の系統を用いて，異なる染色体領域が置換されるように選抜すると，全ゲノム領域が置換された系統群が作製できる．以上のささやかな戦略をもってて，著者らは研究を展開した．

4～5葉期の日本晴およびカサラスの幼苗をジャスモン酸（1 mM, 4回噴霧）で処理し，48時間後に植物体を塩酸水溶液（0.1 N）で抽出した．抽出液を6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate（AQC試薬）で処理し，得られた非タンパク質性アミノ酸を誘導体化した．これを蛍光検出器（励起光259 nm；蛍光395 nm）つきのHPLCまたはLC/MSで分析した．得られたクロマトグラムを図2に示す．保持時間26分付近に日本晴では検出されるがカサラスには検出されないピークが認められた．さらに，このピークは22種類のリボソーム取り込みアミノ酸とは一致しなかった．このように，幸運にも，標的とする化合物は比較的簡単に見いだされた．しかしながら，この化合物がβ-チロシンと同定できるまでには少なからず時間がかかった．この化合物をOrbitrap MSで分析したところ，標的化合物の精密質量としてm/z 352.128が得られた．この値はL-チロシンのAQC誘導体の精密質量と一致した．さらに，L-チロシン誘導体の主要なフラグメントイオンとしてm/z 312.237（F1）とm/z 267.180（F2），標的化合物ではm/z 298.221（F1′）とm/z 253.164（F2′）が認められた．F1とF1′，F2とF2′の差は，いずれも14.016となり，メチレン鎖（–CH₂–）の差に相当した．GC/MSでの経験から，得られたフラグメントイオンの開裂パターンを解析して構造上の情報を得ようとしたが，徒労に終わった．以上の結果から，標的化合物がL-チロシン類縁体と推察されたが，β-チロシンとは同定できなかった．

図2 日本晴れ（ジャポニカ品種）抽出物から検出されたβ-チロシンの液体クロマトグラム

同様に処理したカサラス（インディカ品種）の抽出物からは検出されなかった．

仕方なく大量の日本晴を栽培し，その抽出物から力業で標的化合物の構造決定することに覚悟を決めたころ，著者の一人がβ-チロシンの可能性を口にした．標品を購入し，ethyl chloroformateで誘導体化しGC/MS分析したところ，予想されたフラグメントイオンが得られただけでなく，開裂パターンもα-チロシンと明確に区別できた（図3）．そこで，日本晴から調製したサンプルをethyl chloroformateで誘導体化しGC/MS分析したところ，GC/MSの保持時間とフラグメントパターンが完全に標品と一致して，標的化合物をβ-チロシンと同定した^28）．植物からβ-チロシンを同定したのは初めてである．前述のとおり，β-チロシンは，さまざまな細菌によって生合成されており，抗生物質の構成単位となっている．（3S）-β-チロシンはBacillus brevis由来のedeine AおよびB^24），Streptomyces globisporus由来のC-1027^25）そしてMyxococcus fulvus由来のmyxovalargin^26）に含まれ，（3R）-β-チロシンはChondromyces crocutus由来のchondramide C^27）に含まれる（図1）．

図3 α-チロシンおよびβ-チロシン誘導体のGC/MS開裂パターンの比較

そこで，日本晴由来のβ-チロシンのアミノ基の立体化学の決定を試みた．O-phthaldialdehyde N-acetyl-L-cysteineと反応させ，β-チロシン誘導体のジアススレテオマーを得た．これをLC/MSで分析したところ，その保持時間（図4）および開裂パターン（データ未記載）から，その立体化学をR体と結論した．

図4 β-チロシンにおける3位のアミノ基の立体化学の決定

上述したβ-チロシン（細菌）およびβ-フェニルアラニン（イチイ）は天然アミノ酸である（2S）-α-チロシンまたは（2S）-α-フェニルアラニンから変換される．すなわち，α炭素に結合したアミノ基が隣接するβ炭素に移動する分子内反応を触媒するaminomutaseによって可逆的に反応が進行する．この反応を触媒する酵素であるphenylalanine aminomutase（PAM）とtyrosine aminomutaseの構造は，天然の（2S）-α-フェニルアラニンから（E）-cinnamic acidを脱アミノ反応により生成するphenylalanine ammonia-lyase（PAL）の構造，同様に（2S）-α-チロシンからp-coumaric acidを生成するtyrosine ammonia-lyase（TAL）の構造と類似している．いずれも，酵素の活性中心の近傍にXaa-Ala-Ser-Gly-Xaaから構成されるアミノ酸配列があり，グリシンのアミノ基の非共有電子対がアラニンのカルボニル基を攻撃し，五員環の求電子的な4-methylideneimidazole-5-one（MIO）を形成する点に特徴がある（図5A）．MIO部分を持つaminomutase（PAM/TAM）の反応機構は次のように考えられている．まず，MIO部分のカルボニル基が立ち上がると同時に（2S）-α-チロシンのアミノ基の非共有電子対が末端のメチリデン基の炭素を攻撃する．続いて，（2S）-α-チロシンのβ炭素に結合した水素が脱プロトン化され，アミノ基がMIO部分に結合して脱離する．ともにMIO部分を含むammonia-lyaseとaminomutaseは同様な触媒機構により，まずα,β-不飽和カルボン酸を生成する（図5B）．続いて，ammonia-lyaseではMIO部分に結合したアミノ基がアンモニアとして遊離する．一方，aminomutaseではアミノ基がマイケル反応によりα,β-不飽和カルボン酸のβ位に付加し，β-アミノ酸を生成する（図5B）^29–31）．

図5 4-methylideneimidazole-5-one（MIO）モチーフを持つaminomutaseとammonia lyaseの形成と触媒反応^{29, 30, 32）}

（A） Ala-Ser-GlyモチーフからなるMIOモチーフの形成機構．（B） MIOモチーフを持つtyrosine 2,3-aminomutase（TAM）（上）とphenylalanine ammonia-lyase（PAL）（下）が触媒する酵素反応の機構．

著者らは，日本晴から同定された（3R）-β-チロシンも同様に（2S）-α-チロシンから変換されると予想し，すべての炭素および窒素が¹³Cおよび¹⁵Nでラベルされた（2S）-α-チロシンを日本晴の葉柄に塗布し2日間インキュベート後，日本晴からアミノ酸を抽出し，LC/MSで分析した．その結果，¹³C，¹⁵Nでラベルされた（3R）-β-チロシンを検出した（図6）．以上の結果，日本晴から同定された（3R）-β-チロシンはtyrosine 2,3-aminomutaseにより生合成されたと結論した．

図6 ラベル体α-チロシンのβ-チロシンへの取り込み

前述したように，（3R）-β-チロシンは日本晴（ジャポニカ品種）には検出されるがカサラス（インディカ品種）には検出されない．また，ジャスモン酸によりその生合成は活性化される．そこで，日本晴／カサラスの染色体断片置換系統の全54系統を解析し，（3R）-β-チロシンが検出されない，すなわち表現型がカサラスとなる系統を探した（図7）．その結果，系統18, 51そして53系統の表現型がカサラスであった．これらの3系統で日本晴の遺伝子がカサラスに共通して変換されている遺伝子の箇所は，イネ12番染色体の領域C1060-C449であり，この領域にはおおよそ100個の遺伝子が存在した．さらに，（3R）-β-チロシンの生合成に関わる遺伝子はtyrosine aminomutaseと予想され，ジャスモン酸によって活性化される遺伝子であることも考慮して，遺伝子を絞り込んだ．その結果，LOC_Os12g33610遺伝子が2,3-aminomutaseの候補遺伝子として浮かび上がった．データベースでは，LOC_Os12g33610遺伝子はphenylalanine/histidine ammonia-lyase family proteinと注釈されていた．すなわち，この遺伝子はammonia-lyaseの酵素をコードすると考えられていたわけである．上述したように，ともにMIO部分を含むammonia-lyaseとaminomutaseは同様な触媒機構によりα,β-不飽和カルボン酸を生成するので，遺伝子配列からでは区別できなかったのである．著者らが調べたところ，実際にはOsTAM1には（2S）-α-チロシンからp-coumaric acidを生成するammonia-lyase活性は確認されなかった．今回の経験から，実際に酵素を発現させて，酵素活性を測定することが愚直ではあるが，非常に重要であること，遺伝子配列やアミノ酸配列からは詰め切れない酵素の機能があることを知った．

図7 日本晴／カサラスの染色体断片置換系統（54系統）におけるβ-チロシンの有無

最終的には，LOC_Os12g33610遺伝子をNicotiana benthamianaや大腸菌に異種発現させて，その酵素が（2S）-α-チロシンを（3R）-β-チロシンに変換する2,3-aminomutase活性を確認して，OsTAM1遺伝子と命名した．

著者らの報告の後，WalkerらはOsTAM1の詳細な反応機構の研究を行い，日本晴由来のOsTAM1は（2S）-α-チロシンを（3R）-β-チロシンと（3S）-β-チロシンの両方に変換するが，前者へのエナンチオマー過剰率は94％eeであり，その選択性は非常に高いことが判明した^32）．この報告は，著者らの実験結果ともよく一致している．この値は，現在知られている細菌由来のtyrosine 2,3-aminomutaseのエナンチオ選択性よりも高く，植物由来のtyrosine 2,3-aminomutaseとしてユニークな特徴となっている^26）．また，OsTAM1に（2S,3R）-［2,3-²H₂］-α-チロシンを反応させると，（3R）-β-チロシンのα炭素に重水素が置換したものが23％，プロトンが置換したものが77％生成した（図8）．このプロトンの置換は，イチイ由来のphenylalanine aminomutaseでも報告されている．

図8 OsTAM1によるα-チロシン［β位の重水素（D）ラベル体］のβ-チロシン置換時におけるα位の重水素ラベル化率

また，本報告を日本農芸化学会（2015年）で行った際に，加藤康夫教授（富山県大）から「OsTAM1遺伝子が微生物由来の可能性はないか」という，大変興味深い質問をいただいた．すなわち，細菌由来のTAMが日本晴に水平移動で伝播した可能性についての質問である．その場では質問に答えられなかったが，後日，著者らは微生物および高等植物よりPAL関連タンパク質のアミノ酸配列を収集し，アライメント解析を行った．その結果，これらの遺伝子は単一祖先遺伝子に由来し，種が分化したのちにそれぞれの種内で固有の変異を蓄積していることが示唆された（図9A）．さらに，現在の高等植物が保有するPAL遺伝子は単一起源であり，単子葉植物と双子葉植物に分化したのちに遺伝子数を増加させてきたことも示唆された．イネとトウモロコシの間ではPALオーソログ間の相同性が高く，これらの遺伝子が同一祖先より分化したことを強く裏づけている．一方，OsPAL8とOsTAM1はイネとトウモロコシのオーソログ分化よりもずっと後になってから分化しており，92％という高い相同性からもOsTAM1はイネにおいてOsPAL8との共通祖先から独自に派生した遺伝子である可能性が高いと考えられる．イネのPALファミリーにおいてチロシンを基質とするのはOsTAM1のみである．そこで，基質特異性に関与すると考えられている領域（selectively switch region）に着目すると，高等植物のPALファミリーの多くはPhe-Leuを有するのに対し，OsTAM1ではこの領域を含む10アミノ酸の欠失が認められた（図9B）^33）．このような欠失と基質特異性との関連は未解明であるが，同領域にSer-Hisを有する微生物のTAMファミリーとは明確に異なった構造的特徴である．以上より，OsTAM1はイネにおいて生じた固有の変異に起因するtyrosine aminomutaseであると推察され，本遺伝子は微生物からの水平移動ではないと結論した．

図9 微生物および高等植物におけるPAL関連タンパク質のアライメント解析

（A） PAL関連タンパク質の系統樹．微生物［Myxococcus sp. Mx-B0（MxTAM）, Chondromyces crocatus（CmdF）, Streptomyces globisporus（SgcC4）, Rhodobacter sphaeroides 2.4.1（RsTAL）, Rhodobacter capsulatus（RcTAL）, Pseudomonas putida（PpHAL）, Saccharothrix espanaensis（SeTAL）, Rhodobacter capsulatus（NpPAL）, Trichormus variabilis ATCC 29413（AvPAL）, Rhodotorula toruloides（RtPAL）］および高等植物［Oryza sativa（OsPAL1, OsPAL2, OsPAL3, OsPAL4, OsPAL5, OsPAL6, OsPAL7, OsPAL8, OsTAM1）, Zea mays（GRMZM2G074604_T01, GRMZM2G441347_T01, GRMZM2G081582_T01, GRMZM2G118345_T01, GRMZM2G170692_T01, GRMZM2G029048_T01, GRMZM2G334660_T01, GRMZM2G063917_T01）, Arabidopsis thaliana（AtPAL1, AtPAL2, AtPAL3, AtPAL4）, Glycine max（Glyma.19G182300.1, Glyma.03G181700.1, Glyma.03G181600.1, Glyma.13G145000.1, Glyma.10G058200.1, Glyma.20G180800.1, Glyma.10G209800.1, Glyma.02G309300.1）, Taxus chinensis（McTAM）, Taxus canadensis（TcPAM）］のPAL関連タンパク質アミノ酸配列をMEGA ver. 10.1.7（https://www.megasoftware.netより入手可能）のClustal Wでアライメント解析を行い，Neighbor joining法で系統樹を作成した^34）．OsTAM1を赤下線で強調している．（B）アライメント解析におけるOsPAL8の123～135アミノ酸領域．図中の赤枠はselectively switch regionを表す．

当初の思惑どおり，我々はイネから新規の非タンパク質性アミノ酸（3R）-β-チロシンを発見し，その生合成経路および遺伝子を同定した．しかし，（3R）-β-チロシンがイネの防御にどう働くのか，そもそも防御に関わるのか，その生理的・生態的意義はいまだ不明である．現在わかっている（3R）-β-チロシンの機能の一つに双子葉植物に対する特異的な根の伸長阻害がある．たとえばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）では1 µM以下で根の伸長を阻害する．この特徴は双子葉植物選択的な新規除草剤への応用が期待される．また，（3R）-β-チロシンはイネの種子，つまり米にも標準アミノ酸に匹敵する濃度が含まれている．したがって，我々は日々（3R）-β-チロシンを摂取しており，この非タンパク質性アミノ酸がヒトの体内でどのように代謝されるのかも非常に興味深い点である．