生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

トランスファーRNA（tRNA）は，タンパク質の翻訳に不可欠なノンコーディングRNAであり，mRNAの遺伝暗号とタンパク質のアミノ酸を物理的に結びつけている．tRNAがその機能を発揮するためには，前駆体tRNA（pre-tRNA）が，5′および3′余剰配列の除去，塩基修飾，スプライシング，3′末端へのCCA配列付加など，一連の成熟化プロセスを経る必要がある．リボヌクレアーゼP（RNase P）は，この成熟化プロセスの中で，pre-tRNAの5′側の余剰配列（5′-leader配列）の除去に関わるエンドリボヌクレアーゼである．このRNase Pの「P」は前駆体「precursor」のPに由来する．この成熟化プロセスは，あらゆる生命にとって必須であり，RNase Pはハウスキーピング遺伝子の一つである．RNase Pは，その基質認識サイトと触媒中心が核酸であるRNAに存在する「リボザイム型」のみが長らく知られていた．しかし，近年，リボザイム型とはまったく形態の異なる，基質認識サイトと触媒中心がタンパク質に存在する「エンザイム型」RNase Pの存在が明らかになった．これら二つの形態のRNase Pは同一の基質（pre-tRNA）を認識し，同一の酵素反応を担っている（図1）．本稿では，我々が行っているエンザイム型RNase Pの構造解析を中心に，RNase Pの多様性とダイナミックな分子進化について紹介する．

図1 RNase Pの多様な分子形態

（a）細菌Thermotoga maritimaのリボザイム型RNase P-tRNA複合体のX線結晶構造^2）．PDB ID：3Q1Q. （b）古細菌Methanocaldococcus jannaschiiのリボザイム型RNase P-tRNA複合体のクライオ電顕構造^5）．PDB ID：6K0B. （c）ヒトのリボザイム型RNase P-tRNA複合体のクライオ電顕構造^4）．PDB ID：6AHU. （d）植物Arabidopsis thalianaのエンザイム型RNase P（PRORP）のX線結晶構造^8）．PDB ID：4G24. （e）細菌Aquifex aeolicusのエンザイム型RNase P（HARP）のX線クライオ電顕構造^13）．PDB ID：7F3E. RNase P RNA分子を赤系の表面モデルで，tRNAを灰色の原子球状モデルで，タンパク質分子をリボンモデルで，表示している．

細菌，古細菌，真核生物において，リボザイム型RNase Pは，一つのRNA成分といくつかのタンパク質補因子が複合体をとったリボ核タンパク質（RNP）として存在している．タンパク質補因子の数は，細菌では1個，古細菌では4～5個，真核生物では9～10個であり，それぞれ一つのRNA成分との複合体として構成される（図1）．タンパク質補因子はRNA成分の立体構造形成，立体構造維持，安定化に寄与していると考えられている．

このリボザイム型RNase Pは，1983年にSydney Altmanのグループによって，細菌のRNase Pの触媒中心が，タンパク質ではなくRNA成分に存在するリボザイムであることが初めて見いだされた^1）．このAltmanの発見とThomas CechのRNAの自己スプライシングの発見によって，RNAの触媒機能が明らかになり（リボザイムの発見），両名は1989年にノーベル化学賞を受賞している．またこれらのリボザイムの発見は，「RNAワールド仮説」の提唱のきっかけの一つになった．

これらのリボザイム型RNase Pの構造解析は，2010年に細菌のRNase PとtRNA複合体のX線結晶構造が決定されたのが最初である^2）（図1）．この構造解析により，RNase P RNAのCatalytic-Domain（Cドメイン）に触媒中心が存在することや，Specificity-Domain（Sドメイン）の二つのRNA塩基が，tRNAのエルボー領域先端の塩基対（G19-C56）とスタッキングすることによって，基質認識していることが明らかになった（図2右）．このtRNAエルボー領域は，多くのtRNAで構造的に保存されており，tRNAのDループとTΨCループの塩基が塩基対（G19-C56）を作ることによって形成される，tRNAに特徴的な構造である．これらのことから，リボザイム型RNase PはtRNA特有のエルボー領域から切断位置の距離を測る“分子ものさし”として働き，その機能を発揮していることが明らかになった．さらに2018年に酵母とヒトのリボザイム型RNase Pの^{3, 4）}，2019年に古細菌のリボザイム型RNase PのtRNA複合体構造がクライオ電子顕微鏡（以下クライオ電顕）によって決定されている^5）（図1）．これらの構造から，古細菌，真核生物においてもRNase P活性に重要な触媒中心と基質認識の機能はRNA上に保持されていることが明らかになった（図1）．さらにこれらの構造から，細菌RNase P RNAのRNA成分の構造形成，構造維持，安定化に寄与していると考えられている領域が，古細菌，真核生物では徐々にタンパク質因子に移行していると推察されている^4）．

図2 エンザイム型RNase P（PRORP）とリボザイム型RNase Pの基質認識における収斂進化

シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）PRORP1（AtPRORP1）のPPRドメイン-tRNA複合体のX線結晶構造（PDB ID：6LVR, 左）と既知のリボザイム型リボヌレアーゼP（細菌）-tRNA複合体X線結晶構造（右）．エンザイム型もリボザイム型も基質であるtRNAのエルボー領域を同様の方法で基質を認識している（中央）．

リボザイム型RNase Pの発見の経緯から，RNase Pは，リボザイムを代表する分子であり，リボザイム型のみが存在していると長らく考えられてきた．しかし，植物の核，オルガネラや動物のオルガネラで働くRNase Pの存在は30年近く未同定であった．2008年に，ヒトのミトコンドリアで，タンパク質だけから構成される酵素複合体（mitochondrial RNase P protein：MRPP）がRNase P活性を持つことが同定された^6）．このMRPP複合体は，三つのMRPP1, MRPP2, MRPP3タンパク質で構成され，それぞれ，methyltransferase, dehydrogenase, ribonucleaseと相同性のあるタンパク質であった．これら三つのタンパク質がヘテロ複合体を形成することによって，RNase P活性を有しており，活性中心はribonucleaseであるMRPP3に存在している．これら三つのタンパク質は，リボザイム型RNase Pの構成タンパク質とはまったく相同性がなく，異なる起源を持つタンパク質であると考えられる．さらに2010年にシロイヌナズナで，MRPP3と相同性のあるタンパク質が，単独でRNase P活性を有することが発見され^7），このタンパク質はprotein-only RNase P（PRORP）と命名された．シロイヌナズナでは三つのPRORPアイソフォームが存在し，PRORP1はオルガネラに，PRORP2とPRORP3は核に局在している．その後，PRORPのオーソログは，さまざまな真核生物で同定されている．真核生物において，リボザイム型RNase PとPRORPの局在は相互に排他的である．つまり，植物では，核，ミトコンドリア，葉緑体のすべてにおいてPRORPのみが機能しているが，動物では，核においてはリボザイム型RNase Pのみが，ミトコンドリアにおいてはPRORP（MRPP）のみが働いている．

PRORPの構造解析は，シロイヌナズナPRORP1の構造解析が2013年に初めて報告された^8）（図1）．その後，シロイヌナズナPRORP2，ヒトMRPP3の構造が決定されている^{9, 10）}．その構造は，pentatricopeptide repeat（PPR）ドメインとヌクレアーゼドメインを中間の亜鉛結合ドメインが橋渡ししたΛ（ラムダ）状の構造をしている（図1）．PPRドメインがpre-tRNA認識を，ヌクレアーゼドメインが5′-leader配列の切断を担っていると考えられている．このPPRドメインとヌクレアーゼドメインとの位置関係はリボザイム型RNase PのSドメインとCドメインの位置関係と類似しており，PRORPもリボザイム型RNase Pと同様に分子ものさしとして働いていることが示唆されている（図1）．しかし，その詳細な，基質認識の構造基盤は不明であった．

我々は，PRORPの詳細な基質認識メカニズムを解明するために，シロイヌナズナPRORP1（AtPRORP1）と基質pre-tRNAとの複合体のX線構造解析を試みたが，成功に至らなかった．そこで次にAtPRORP1のPPRドメインの可溶化に成功したため，このPPRドメインと酵母tRNA^Pheの複合体結晶構造を決定した^11）（図2左）．複合体構造より，AtPRORP1のPPRドメインは，tRNAのエルボー領域に特異的に結合していることが明らかになった．その結合様式は，PPRドメインが，tRNAエルボー領域先端にあるG19-C56塩基対を，主に疎水的相互作用で認識しているものだった．さらに二つのアルギニン残基がtRNAエルボー領域の主鎖のリン酸基と相互作用し，三つ目のアルギニン残基が，tRNAのψ55塩基と相互作用していた（図2左）．このPPRドメインのtRNAエルボー領域への特異的認識は，リボザイム型RNase Pの二つのRNA塩基によるtRNAエルボー認識に非常に類似した結合様式である．このことは，タンパク質とRNAというまったく異なる分子種が，同じ基質（pre-tRNA）を認識するために，原子レベルで同様の基質認識機構を持った，収斂（しゅうれん）進化の例である（図2）．これは，天然に存在する同一反応を触媒するエンザイムとリボザイムが同じ基質を同様の方法で認識するということを明確に決定した，我々の知る限り最初の例である．

2017年に超好熱性細菌Aquifex aeolicusで，PRORPとは異なるタイプのエンザイム型RNase PであるAq880が同定された^12）．このタンパク質は，ヌクレアーゼドメインのみと考えられた約23 kDaの酵素である．このAquifex RNase Pのホモログは，いくつかの細菌や古細菌でも発見され，HARP（homolog of Aquifex RNase P）ファミリーと命名された．この最小サイズのエンザイム型RNase PであるHARPがpre-tRNAをどのように認識して切断するのかを明らかにするために，我々は，Aq880のクライオ電顕単粒子構造解析によって，立体構造を決定した^13）．決定した構造から，Aq880は，ヌクレアーゼドメインと，予想外にも突出したα-helix（PrH）ドメインから構成されていることが明らかになった（図3）．Aq880単量体は，PrHドメインを介して二量体を形成し，さらに六つの二量体が，左巻きのらせん構造を持つユニークな六つの角が突き出た六芒星形（✡）の12量体を形成していた．この12量体形成は，HARPファミリー共通の特徴であると考えられるため，我々はHARPをhexagram-like assembly proteinaceous RNase Pの略に言い換えることを提案している．pre-tRNAのドッキングモデルにより，Aq880のpre-tRNAの特異的切断は，12量体中の隣接する二つの二量体によって達成されると予想した（図3）．一つの二量体が切断触媒を担い，もう一方の二量体のPrHドメインがpre-tRNAのエルボー認識を担っており，12量体中に最大10分子のpre-tRNAを結合することができると考えられる．これらのことは，HARPもPRORPやリボザイム型RNase Pと同様にtRNA特有のエルボー領域から5′切断位置の距離を測る“分子ものさし”として働き，機能していることを示唆している（図3）．小さなタンパク質であるHARPが多量体化によって機能を持つことは，コンパクトなゲノムを持つゆえのA. aeolicusの戦略と考えられる．

図3 最小サイズのエンザイム型RNase P（HARP）の多量体化とRNase Pの“分子ものさし”としての共通性

RNase Pは，どの分子形態でもtRNAのエルボー領域から切断部位までの距離（約42 Å）をみることで，特異的な切断を行う．HARP-tRNA複合体モデルは，tRNAを1分子だけ結合させたモデルだが，最大10分子結合可能だと考えられる．

我々の，PRORPやHARPの構造解析によって，PRORPはヌクレアーゼドメインにtRNAエルボー認識モジュールとしてPPRドメインを融合することによって，HARPは多量体化することによって，巨大リボ核タンパク質複合体であるリボザイム型RNase Pと同じようにtRNA特有のエルボー領域を認識して，tRNA前駆体の特異的切断を達成していることが明らかになった（図3）．これらは，「RNAワールド仮説」を考える上で，RNAの役割がタンパク質へ移行する過程で，タンパク質でも機能を持つための生命の戦略と考えることができる．これは，生命の起源の解明にも貢献するものとして注目される．RNase Pは，まったく同一の触媒反応をするにもかかわらずさまざまな形態の酵素が存在し，酵素の多様性とのダイナミックな分子進化を示している．