生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

特定の生物が乾燥や極低温などの厳しい環境に対して生命活動を停止する無代謝状態をクリプトビオシス（cryptobiosis，「隠された生命活動」の意）というが，その中でも乾燥条件に応答して誘導されるのが「乾眠」である^1）．乾眠状態にある生物は，すべての代謝が停止した状態で乾燥した環境を生き延び，給水すると乾眠状態から活動状態へと復帰し，代謝を再開する能力を持っている（図1）．さらに，乾眠状態では，乾燥に加えて，温度，圧力，放射線，化学物質といった極限環境条件に対しても強い耐性を示すことが知られている．したがって，乾眠機構を明らかにすることは，生命の環境適応の分子戦略を理解する上で重要な手がかりを与えるとともに，ワクチンや細胞などの新たな保存方法を提供することが可能となり，医療やバイオテクノロジーへの応用研究の推進にもつながることが期待される．

図1 クマムシは生育環境から水がなくなると「乾眠」と呼ばれるすべての代謝が停止した状態となることで乾燥した環境において生き延び，給水すると乾眠状態から復帰して代謝を再開する能力を持っている．クマムシ画像は荒川和晴博士より提供

乾眠生物の中でも，緩歩動物門に属するクマムシは，特に強い乾燥耐性および極限環境耐性を有することが知られており，しばしば“地上最強生物”と呼ばれる（図1）．クマムシのゲノム解析により，クマムシの乾眠関連遺伝子として複数の遺伝子が発見され，クマムシ固有のタンパク質の存在が浮き彫りとなってきた^2）．しかしながら，乾燥耐性におけるそれらのタンパク質の役割はほとんど明らかとされていなかった．本稿では，クマムシ固有タンパク質に着目し，クマムシの環境適応戦略について紹介する．

クマムシのストレス環境に対する防御メカニズムとして，熱ショックタンパク質もしくは低温ショックタンパク質の誘導や，ペルオキシダーゼの誘導，また，筋タンパク質フィラメントによる体構造の安定化や再編成など，これまでにいくつかのメカニズムが提唱されている^{1, 3）}．線虫，ネムリユスリカ，アルテミアなど，乾眠生物の中には脱水時に細胞内に高濃度のトレハロースを蓄積し，水分保持やガラス化を通じて乾燥耐性を示すものもある^1）が，クマムシの場合はトレハロースの蓄積レベルは種によって異なっており，トレハロースの蓄積だけでは乾眠の仕組みを説明できない．一方，LEA（late embryogenesis abundant）タンパク質は，もともと植物から発見されたタンパク質で，種子の乾燥耐性に関わっていることが知られている．LEAタンパク質は高い親水性と熱可溶性を有する天然変性タンパク質であり，乾燥時における役割として，トレハロースによるガラス化の補強や水分保持，他のタンパク質の変性・凝集保護といったいくつかの仮説が提唱されている^4）．近年，LEAタンパク質は線虫やワムシといった一部の乾眠動物においても発見され，植物だけでなく動物の乾燥耐性獲得にも関与していることが示唆されている^4）．しかしながら，クマムシのトランスクリプトーム解析の結果，LEAタンパク質遺伝子はクマムシ種の広範にわたって保存されているものの，転写産物としては必ずしも豊富ではないことが明らかとなった^5）．これらのことから，クマムシの乾眠メカニズムは他の動物とは異なり，何かしらのクマムシ独自の成分を使って乾燥耐性を獲得している可能性が示唆された．

近年，クマムシの全ゲノム情報が決定され，陸生のクマムシの一種であり高い乾燥耐性を示すRamazzottius varieornatus（ヨコヅナクマムシ）においては全体の約40％は他の生物種の遺伝子とは相同性を示さないクマムシ固有の遺伝子であることが判明している^{2, 5）}．熱可溶性タンパク質のファミリーとして，CAHS（cytosolic abundant heat-soluble）タンパク質，SAHS（secretory abundant heat-soluble）タンパク質，MAHS（mitochondria abundant heat-soluble）タンパク質などが見つかった^{1, 2, 6, 7）}．その他にも，放射線照射に伴うDNA傷害に対して保護作用を有するDsup（damage suppressor）タンパク質^8）や，ゴルジ体に局在して抗酸化作用に関わるマンガン依存性ペルオキシダーゼ^9）が同定され，これらのクマムシ固有タンパク質がさまざまなストレス耐性に関与していることが明らかとなってきた．

CAHS遺伝子は，R. varieornatusやHypsibius exemplarisが属する真クマムシ綱のすべての種において保存されている．R. varieornatusは，水分を消失した状態においても細胞を保護するために，CAHSタンパク質をはじめとするいくつかのクマムシ固有のタンパク質を恒常的に発現し，細胞内に常備していると考えられている^{2, 5）}．一方，H. exemplarisでは，CAHSタンパク質は乾燥ストレス条件下で強く誘導されることが示されている^{2, 5, 10）}．異クマムシ綱においてはCAHS遺伝子の発現は認められなかったが，同綱に属するEchiniscus testudoのマルチオミクス研究により，二つの新規熱可溶性タンパク質ファミリーが同定された^11）．これらのタンパク質は，CAHSとはアミノ酸配列の相同性はないものの，CAHSタンパク質と類似の構造的特徴を有していることが明らかとなっている．したがって，CAHSタンパク質そのものの保存性は低いものの，類似タンパク質の存在まで考慮すると，CAHS（およびCAHS-like）タンパク質は，すべてのクマムシに共通な乾眠関連分子である可能性が高い．

我々は，R. varieornatus由来のCAHSタンパク質のアイソフォームの一つであるCAHS1を対象に，in vitroおよびin vivoにおける分子集合体の形成について，一連の分光学的手法および顕微鏡観察により解析した^12）．その成果を以下に紹介する．

1）CAHS1タンパク質のin vitroにおける繊維形成

CAHS1タンパク質のN末端領域はランダム構造をとり，C末端領域はαヘリックス構造をとることがアミノ酸配列より予測されていたが，NMR解析の結果から，C末端領域は，実際はモルテングロビュール状態にあり，緩いαヘリックス構造を形成していることが判明した（図2A）．そして，CAHS1タンパク質の濃度を上げるにつれてNMRピークが消失していき，最終的にN末端側に位置する天然変性領域に由来するピークのみが観測された．このことから，CAHS1タンパク質は高濃度条件下においてC末端側のαヘリックス領域を介して会合し，N末端領域は高い運動性を保っていることがわかった（図2A）．実際，CAHS1タンパク質は高濃度でゲル化し，希釈すると可逆的に可溶化することがわかった（図2B）．高速原子間力顕微鏡を用いて，このゾル–ゲル転移現象をリアルタイムで観察したところ，希薄な条件下ではCAHS1タンパク質は球状領域および柔軟な天然変性領域からなる単量体であり，高濃度条件下ではCAHS1タンパク質が自発的に集合し繊維状の構造体を形成していくようすを捉えることができた（図2C）．一方，赤外分光分析および電子顕微鏡観察の結果から，CAHS1タンパク質は脱水に伴ってαヘリックス構造の形成と同時に繊維化し，乾燥条件下においても繊維構造を維持していることが示唆された（図2D）．

図2 クマムシに豊富に存在するタンパク質CAHS1のin vitroおよびin vivoにおける集合体形成

（A） CAHS1タンパク質は高濃度で会合し，0.6 mMの条件下ではN末端側に位置する天然変性領域に由来するNMRピークのみが観測された．CAHS1タンパク質は高濃度で（B）ゲルや（C）繊維を形成し，（D）乾燥状態においても繊維構造を保持していた．一方，高浸透圧ストレスをかけると，（E）細胞内に粒子状の集合体を形成するようすが観察された．文献12より引用・改変．

以上の実験データから，クマムシの細胞内に豊富に存在するタンパク質CAHS1は，脱水が引き金となってC末端領域のαヘリックス構造を介して自発的に集合して繊維構造を形成し，ハイドロゲルの形成に至ること，さらに，そのような繊維状の構造体は乾燥状態においても保持され，給水に伴って解離して単量体に戻ることが明らかとなった．これらのことから，CAHS1タンパク質はハイドロゲル化することにより水分を保持し，代謝などの生命活動が強制終了しないように，緩やかに乾眠に誘導するのに役立っていることが想定される．一方，乾燥状態においては，CAHS1タンパク質の網目状の繊維構造体は，緩衝材のように細胞内に張り巡らされた状態で細胞の構造維持に役立っているとともに，“ドライシャペロン”として乾燥に弱いタンパク質を変性から保護したり，オルガネラ機能の完全性の維持に関与している可能性がある．さらに，給水過程においては，繊維構造体からハイドロゲルを経て単量体に解離していくことで，生命活動の再開を適切に調整しているのかもしれない．

2）CAHS1タンパク質のin vivoにおける可逆的な集合体形成

筆者らは，CAHS1タンパク質が細胞内の分子クラウディング条件下において繊維構造を形成する可能性について検討した．遺伝子組換えタンパク質としてCAHS1タンパク質を大腸菌に過剰発現させたところ，本タンパク質が大腸菌の細胞内においても繊維構造を形成することが確認された．さらに，蛍光タンパク質を融合したCAHS1タンパク質をヒト由来の培養細胞に過剰発現し，高浸透圧ストレスをかけると，細胞質全体に均一に分布していたCAHS1タンパク質が，細胞質および核において速やかに集積して粒子状の集合体を形成し，ストレスがなくなるとこうした集合体は消失して元の状態に戻ることが明らかとなった（図2E）．こうしたCAHS1タンパク質の集合体が細胞質で形成するコアセルベート様の液滴は，脱水過程において，脱水ストレスから他の生体分子を保護するための可逆的な“保護区画”を形成し，乾燥耐性に寄与している可能性がある．

以上のように，CAHS1タンパク質の段階的な繊維状のネットワーク構造体の形成は，本タンパク質が乾燥に至る各ステップにおいて，“水分保持”，“保護区画の形成”，“ドライシャペロン”，“細胞の構造維持”といった多面的な役割を担っている可能性を示唆するものである．

本稿ではCAHS1を対象とした研究成果を紹介したが，実際R. varieornatusは少なくとも16種類のCAHSタンパク質アイソフォームを発現していることが知られている^{2, 5）}．最近，CAHS3やCAHS12に関しても，in vitroで可逆的にゾル–ゲル転移を起こすことや，培養細胞において高浸透圧ストレスに応答して可逆的に重合して繊維化することなどが報告されている^13）．したがって，一連のCAHSタンパク質アイソフォームは，それぞれ異なる集合体としての特性を発揮し，乾眠過程において異なる役割を協調的に担っている可能性が考えられる．さらに，H. exemplarisのCAHS8（CAHS D）は繊維構造からなるゲルを形成すること^14），H. exemplarisのCAHS3やParamacrobiotus richtersiのCAHS2は液滴を形成すること^15）などが相次いで報告されており，CAHSタンパク質の環境依存的な集合・離散に伴う繊維化，液滴化，ゲル化といった分子集合体の形成は，クマムシに共通な環境適応戦略として重要であると考えられる．今後，クマムシ固有タンパク質の包括的な構造機能解析がますます重要になってくるだろう．