川崎医科大学薬理学教室Department of Pharmacology, Kawasaki Medical School ◇ 〒701–0192 岡山県倉敷市松島577 ◇ 577 Matsushima, Kurashiki, Okayama 701–0192, Japan
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リゾホスファチジン酸（LPA）は，真核生物の組織や血漿中に存在する脂質メディエーターとして知られている．LPAは，少なくとも8種類のGタンパク質共役型受容体を介して，細胞増殖，血小板凝集，平滑筋収縮，がんの浸潤・転移などさまざまな生物学的過程を制御している．LPA生合成酵素としてはリゾホスホリパーゼD（lyso-PLD）型酵素である血漿中のオートタキシン（ATX）がよく知られており，リゾホスファチジルコリン（LPC）などのリゾリン脂質を加水分解することでLPAを生成する（図1）．一方，グリセロホスホジエステラーゼ（GDE）ファミリーのメンバーであるGDE4およびGDE7は，細胞内のlyso-PLD型酵素であり，ATXと同様のLPA生成活性を有する．特筆すべきこととして，GDE4とGDE7は，酵素活性にそれぞれMg2＋とCa2＋を必要とすることがあげられる．ATX, GDE4およびGDE7は共通してLPAを産生するが，局在，二価金属イオン依存性，基質特異性などの違いから，それぞれ独自の役割を担っている可能性がある．本稿では，GDE4およびGDE7の活性を選択的かつ簡便に測定するために我々が最近開発した，蛍光基質を用いたアッセイ系について紹介する．
近年，ATXは，がん，肝硬変，特発性肺線維症などの病態との関連で注目されていることから，ATX阻害薬のスクリーニングが盛んに行われている．実際に，FS-3やCPF-4などの蛍光基質を用いたハイスループットスクリーニングにより，多くのATX阻害薬が同定されている1, 2）．一方，GDE4は網膜色素変性症3），GDE7は脂肪肝4），がん再発5），騒音性難聴6）などへの関与が報告されている．また，GDE7をコードするGDPD3遺伝子は染色体16p11.2領域のブレークポイント4–5間に位置し，この部分のコピー数変異は精神神経疾患や肥満関連症候群の発症リスクを増大させることが知られている7）．選択的阻害薬はこうした疾患の病態理解に有用なツールになりうるが，これまでにGDE4やGDE7に対する阻害薬は報告されていない．阻害薬が未開発である一因として，これらの酵素活性が薄層クロマトグラフィー，遊離コリンの定量あるいは質量分析といった一度に測定できるサンプル数が限られる手法により測定されていることがあげられる8–10）．たとえば，筆者らが汎用している放射標識脂質を用いた測定系は感度が高いものの，酵素反応に続き，反応停止・脂質抽出，薄層クロマトグラフィー，放射線画像解析といった手順で構成されており，阻害薬探索のようなハイスループット解析への適用は難しいという問題があった．
筆者らはこうした問題を解決するため，蛍光基質を用いた酵素活性測定系の確立を試み，FS-3に着目した（図2）．FS-3は市販のATX活性測定用蛍光基質であり，分子内蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）による蛍光消光モチーフを持つことを特徴とする11）．すなわち，FS-3に含まれる蛍光基フルオレセインは近接する消光基DABCYLによってその蛍光が抑えられているが，ATXによってFS-3が加水分解されるとFRETが解消されて蛍光性を示すようになる．この原理により，蛍光強度の時間変化からATX活性をリアルタイムで定量することができる．筆者らはFS-3がリゾリン脂質アナログであることから，この化合物はGDE4やGDE7の基質としても作用する可能性があると考えた．
実験に用いた酵素源としては，HEK293T細胞にヒトGDE4あるいはGDE7を一過性に過剰発現させ，105,000 gの超遠心分離により得た膜画分を用いた．また，筆者らは内在性のGDE4あるいはGDE7を高発現するヒト前立腺がん細胞株LNCaP，ヒト乳がん細胞株MCF-7の膜画分でもFS-3分解活性を測定できることを確認しており，これらの細胞株ではCRISPR-Cas9系でそれぞれGDE4あるいはGDE7をノックアウトするとFS-3分解活性は顕著に低下する．
FS-3分解活性測定の条件を以下に示す．1～5 µgの酵素タンパク質をトリス-塩酸緩衝液（pH 7.4）中で5 μM FS-3と37°Cで反応させる（図3）．筆者らは黒色の96穴プレート中で反応させており，試薬を節約するために1ウェルあたり60 µLで実施している．GDE4とGDE7にはそれぞれMg2＋あるいはCa2＋要求性があることを利用し，GDE4活性を測りたい場合は2 mM塩化マグネシウムを，GDE7活性を測りたい場合は2 mM塩化カルシウムを加えることでそれぞれの活性を選択的に測定することができる．また，GDE7のFS-3分解活性は，0.1％ Nonidet P-40（NP-40）を加えることで最大5倍程度上昇することを見いだしている．一方，GDE4のFS-3分解活性は同濃度のNP-40によりほぼ完全に阻害される．なお，NP-40はGDE7の［14C］LPC分解活性に対してはむしろ阻害的に働くことを確認しており，FS-3分解活性に限定的な作用であることには注意が必要である．また，標準物質としてフルオレセインを段階希釈して用いている（50 pM～5 μM）．これらのサンプルと試薬の混合直後を0時間としてプレートリーダーで蛍光（励起波長490 nm，蛍光波長520 nm）を測定し，37°Cで3時間静置する．その後，プレートリーダーで再度蛍光強度を測定し，それぞれのウェルごとに3時間と0時間の蛍光強度の差をとることでFS-3分解活性を算出することができる12）．既存の手法と比較した際の長所として，（1）短時間・短工程で活性を測定できること，（2）反応停止操作が不要であり，活性をリアルタイムでもモニターできること，（3）汎用機器（蛍光プレートリーダー）と市販の試薬で実験が行えることがあげられる．感度は放射標識脂質を用いた薄層クロマトグラフィーの方が優れているものの，本法は導入へのハードルが低く，内在性酵素の活性も十分に測定可能な感度を持っている．以上から本法はGDE4およびGDE7の活性測定における有用な選択肢といえる．
筆者らは本FS-3分解活性測定系を用いてGDE4およびGDE7の阻害薬を探索した．種々のLPCアナログや既知のATX阻害薬を評価した結果，LPA誘導体であるBrP-LPA13, 14）および3-carba-環状ホスファチジン酸（3-ccPA）15）がGDE4とGDE7の両者を阻害する活性を持つことを見いだした．BrP-LPAのGDE4とGDE7に対するIC50値は，それぞれ91.5 nMと123 nMであり，3-ccPAではそれぞれ3.14 μMと27.0 nMであった（図4）．これらの阻害薬のATXに対するIC50値はBrP-LPAで22～165 nM, 3-ccPAで294 nMと報告されている．今後，これらの阻害薬を陽性対照とすることで，より特異的にGDE4あるいはGDE7を阻害する化合物の発見につながることが期待される．
蛍光基質FS-3はリゾリン脂質アナログであり，GDE4/7以外のリゾPLDに加えて，リゾPLA1あるいはリゾPLC活性をもつ酵素によっても分解され，蛍光を発する可能性がある．本法では膜画分を用いることや二価金属イオン依存性の違いを利用することでGDE4およびGDE7への選択性を実現しているが，用いる細胞株や組織によっては他の酵素の影響も考慮すべきであろう．特に血中の遊離型ATXが混入している可能性がある場合には，5 μM S3282616）（ATX阻害薬，IC50値198 nM）を加えることで，GDE4/7活性に影響することなくATXを阻害することができる．また，阻害薬のスクリーニングの対象となる化合物の溶媒にはジメチルスルホキシド，メタノールあるいはエタノール等が頻用されるが，FS-3分解活性への影響を考慮し，各有機溶媒の終濃度は0.1％以下にすることを推奨している．加えて，FS-3分解活性測定は一次スクリーニングとして実施し，引き続いて生体内基質であるLPCなどの分解活性に対する阻害効果を確認しておくのがよいだろう．
本アッセイ系で見いだしたGDE4/7阻害薬はこれらの酵素のin vitroでの特性評価や生物学的役割の理解を推進する上で有用なツールになりうる．これまでに，ATXにより血中で生成されたLPAはがんの浸潤・転移等に関与することが知られている．一方，細胞内で産生されたLPAも腫瘍の表現型に影響を与えることが報告されている17–19）．近年，ATXの蛍光基質はin vivo活性イメージングなどにも活用されており，本アッセイ系を発展させることで，腫瘍組織においてどのLPA産生酵素がどの程度活性化しているかを明らかにできれば，診断や治療に貢献できるのではないかと考えている．
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川崎医科大学医学部薬理学 助教．博士（薬科学）．
2011年徳島大学薬学部卒業．16年同大学院博士後期課程修了．同年徳島大学先端酵素学研究所特任研究員．19年より現職．
研究テーマと抱負小胞体におけるストレス応答や脂質代謝の破綻が疾患発症にどのように関わるのかを解明したい．
川崎医科大学医学部薬理学 准教授．博士（薬学）．
1974年奈良市に生る．96年京都大学薬学部卒業．2001年同大学院薬学研究科博士課程修了．香川大学医学部（助手，助教），米国イリノイ大学シカゴ校（学振海外特別研究員）を経て，17年より川崎医科大学医学部講師．21年より現職．
研究テーマと抱負受容体・代謝・シグナル伝達と，脂質メディエーターの生理的役割の解明を目指して様々な側面からアプローチしてきました．日々の研究が人類の健康増進に貢献出来ることを願っております．
ウェブサイトhttps://m.kawasaki-m.ac.jp/classroom/course.php?id=205
https://kms-pharmacol.wixsite.com/website
趣味昼休みエクササイズ．
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