我々の身の回りには化学物質があふれている．たとえば，自ら摂取する医薬品や，受動的に摂取する農薬，無意識に摂取する可能性のある化学物質などである．過去にはそれらの化学物質は，薬害や公害などの多くの悲劇を引き起こした．しかしながら，問題が生じるたびに人類はそれらの安全性を評価する毒性試験法を発展させ，適切な規制をしくことで安全安心な生活を維持してきた．現在は，新規物質の毒性を予測し，事前に危険性を予測する毒性試験法が開発されるなど，毒性試験法は発展し続けている．
数ある毒性試験の中でも，妊婦が摂取することで胚・胎児への影響を評価する発生毒性試験は，ヒトと動物の種差が大きいことが知られている．最も有名な事例として，サリドマイド禍があげられる．サリドマイドはげっ歯類を用いた動物試験では発生毒性を見つけられず，アザラシ肢症と呼ばれる，奇形を生じさせてしまった1）．そのため，発生毒性はげっ歯類に加えて，非げっ歯類を用いた試験を要し，供与動物数，試験期間，コストが必要な試験系である2）- 2) International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonised Guideline, Detection Of Reproductive and Developmental Toxicity for Human Pharmaceuticals S5 (R3), Final version Adopted on 18 February 2020.
．一方，近年の動物福祉精神の高まりを受け，供与動物数の削減，さらには動物試験の廃止が求められている．したがって，ヒトの発生毒性を適切に評価可能な，動物を使用しないハイスループットな試験系が求められている．
4. シグナルかく乱作用のダイナミクスの検出による発生毒性の評価
今回，我々は胚発生過程において重要な役割を果たすシグナルとしてFGFシグナルについて検討し，その下流で発現する血清応答因子（serum response factor：SRF）の応答配列下でNanoLuc（Nluc）を発現するFGF-SRFシグナルレポーターコンストラクトを作製した．それをhiPSCsのゲノム上のセーフハーバー領域の一つであるAAVS1領域にCRISPR-Cas9システムを用いたゲノム編集によりノックインし，SRFシグナルレポーターhiPSCs株を樹立した（図2a）．シグナル伝達の動的変化を計測するために，長期間の生細胞ルシフェラーゼアッセイを可能とするプロメガ社のEndurazineを用いた．なお，多くのタンパク質は37°Cの培地中で生物活性が低下してしまうことが知られているが，37°Cの培地中においても長期間活性が保たれるThermo Fisher Scientific社のHeat stable bFGFを活性化リガンドとして利用することで，この問題を回避した．これらを用いて24時間のFGF-SRFシグナルの生細胞リアルタイムアッセイを行った．レポーター細胞は，bFGF刺激により約6時間で発光がピークに達した後，減少する挙動を示すことが明らかになった（図2b）．
このFGF-SRFシグナルレポーターシステムを用いて，化学物質のシグナルかく乱作用の動的変化の検出を試みた．96穴プレートにレポーター細胞を播種しThermo Fisher Scientific社のStemFlex培地にて3日間コンフルエントまで培養した．その後，FGF不含有のSTEMCELL Technologies社のSTEMdiff APEL2培地で1日培養した．bFGF刺激の3時間前にEndurazineを添加し，1時間前から評価物質を適用した．FGF刺激後，0, 2, 4, 6, 8, 10, 24時間後にNluc発光を計測した（図2c）．評価物質は表1に示す陽性物質18種類，陰性物質11種類計29種類を用いた．評価物質は，細胞毒性IC50以下，もしくは最大溶解量を最高濃度として2倍希釈系列を作製し8濃度を評価した．また，上限濃度は1000 µg/mLとした．FGF-SRFシグナルに対する各化学物質のシグナルかく乱作用を計測した結果，評価物質ごとに異なるタイムポイントでシグナルの増強作用や減弱作用を示すことが明らかになった（図2d）．この結果は，従来のエンドポイント計測だけでは適切な評価が困難であることを示唆している．そこで，シグナル活性の動的変動を解析することで，化学物質のシグナルかく乱作用の定量化を試みた．まず，溶媒対照群に対する評価物質群のシグナル変動率を濃度ごとに算出した．通常の変化率では，増強作用と減弱作用を対称に扱えないため評価物質のシグナルかく乱作用の定量化には向かない．そのため，本解析では，シグナル変動を対数変化率で表した（図2e①，②）．次に，この対数変化率のグラフから溶媒対照と評価物質間の面積（area between curves：ABC）をもとめ，シグナルかく乱の値とした（図2e③）．毒性試験において用量反応関係は重要な指標である．そのため，各濃度のABCを積算したSum of ABCを求めることで，用量反応関係を加味した評価物質のシグナルかく乱作用を定量化した（図2e④）．
表1 評価物質リスト| 化学物質名 | 最大試験濃度（µg/mL） | 判定の正誤 |
|---|
| 陽性物質 |
| トレチノイン | 0.010 | 正 |
| ヒドロキシカルバミド | 149 | 正 |
| メトキシ酢酸 | 683 | 正 |
| 塩化メチル水銀 | 1.20 | 正 |
| メトトレキサート | 5.00 | 正 |
| サリチル酸ナトリウム | 666 | 正 |
| バルプロ酸 | 100 | 正 |
| ホウ酸 | 250 | 誤 |
| 5-ブロモ-2′-デオキシ-ウリジン | 50.0 | 正 |
| ジメタジオン | 840 | 正 |
| 塩化リチウム | 250 | 誤 |
| ジフェンヒドラミン | 262 | 正 |
| フルオロウラシル | 14.1 | 正 |
| シクロホスファミド | 400 | 誤 |
| イマチニブ | 12.5 | 正 |
| レナリドミド | 35.0 | 正 |
| ポマリドミド | 2.50 | 正 |
| サリドマイド | 12.0 | 正 |
| 陰性物質 |
| アクリルアミド | 454 | 正 |
| d-カンフル | 50.0 | 正 |
| フタル酸ジメチル | 100 | 正 |
| ペニシリンG | 1000 | 正 |
| サッカリン | 1000 | 正 |
| アセトアミノフェン | 20.0 | 正 |
| アモキシシリン | 25.0 | 正 |
| シメチジン | 30.0 | 正 |
| エリスロマイシ | 15.0 | 正 |
| ヒドロクロロチアジド | 20.0 | 正 |
| サラゾスルファピリジン | 100 | 正 |
表1 評価物質リスト
上記の定量化手法を用いて，表1の評価物質のシグナルかく乱値を求めた．この値を基にreceiver operating characteristic（ROC）曲線解析により閾値を算出し，その予測性を評価した（図2f）．その結果，感度0.83，特異度1.00，正確度0.93で発生毒性を評価可能であった（表1）12–14）- 12) Kanno, S., Okubo, Y., Kageyama, T., Kitajima, S., & Fukuda, J. (2022) Establishment of a developmental toxicity assay based on human iPSC reporter to detect FGF signal disruption. iScience, 25, 103770.
- 13) Kanno, S., Okubo, Y., Kageyama, T., Yan, L., & Fukuda, J. (2022) Integrated fibroblast growth factor signal disruptions in human iPS cells for prediction of teratogenic toxicity of chemicals. J. Biosci. Bioeng., 133, 291–299.
- 14) Kanno, S., Mizota, K., Okubo, Y., Kageyama, T., Yan, L., & Fukuda, J. (2022) Luciferase assay system to monitor fibroblast growth factor signal disruption in human iPSCs. STAR Protoc., 3, 101439.
．文献12では過去の分類に則り，6-アミノミノニコチンアミドは陽性物質，ジフェンヒドラミンは陰性物質に分類していたが，本稿の試験成績の計算では，6-アミノニコチンアミドの試験結果は評価物質から除外し，ジフェンヒドラミンは陽性物質とした．その理由として，追試されていない昔の試験結果は信頼性に欠け見直しが進められていることおよび，詳細な文献検索の結果，ジフェンヒドラミンは発生毒性を有することが示唆されたためである．また本試験法において，サリドマイドやその誘導体である，レナリドミドやポマリドミドは陽性判定された．このことは発生毒性試験法の大きな課題であった種差が軽減可能である可能性を示している．これらの結果は，化学物質のシグナルかく乱作用の動的変化を検出することで，正確・網羅的に発生毒性が検出可能であることを示している．
今回，FGF-SRFシグナルのみで高い正確度を判別可能であったことは我々にとっても驚きであった．この理由として，FGF-SRFシグナルを直接の標的としない化学物質においても，シグナルかく乱作用の動的変化を計測することで，シグナルネットワークへの影響を捉えられたと考えられる．また，従来法とは異なり，外因性のFGF刺激による，細胞全体への同期したシグナル活性化誘導により，シグナルかく乱作用が検出しやすくなった可能性もある．今回試験に用いたhiPSCsの分化状態は，分化初期段階と考えられ，実際に発生毒性が生じる組織や器官とは異なる．このことは発生の時期・部位にかかわらず，シグナルネットワークを強力にかく乱する物質が発生毒性を引き起こす可能性を示唆している．つまり，発生毒性の生じる部位は胎児に化学物質が曝露されたタイミングにより決定されているかもしれない．
今回，陽性判定されなかったシクロホスファミドは代謝物が毒性を示すことが知られており，in vitro代謝系と組み合わせることで発生毒性を検出可能となることが期待される．また，その他の化学物質に関しても発生毒性に関わる他のシグナル伝達経路が関与している可能性があるので，こうしたシグナル伝達経路のレポーターアッセイを行うことで網羅性の向上が期待される．現在我々はいくつかのシグナル伝達経路の検出を組み合わせたシグナルレポーターバッテリー試験系の構築に取り組んでいる．
引用文献References
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2) International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonised Guideline, Detection Of Reproductive and Developmental Toxicity for Human Pharmaceuticals S5 (R3), Final version Adopted on 18 February 2020.
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5) Aikawa, N., Kunisato, A., Nagao, K., Kusaka, H., Takaba, K., & Ohgami, K. (2014) Detection of thalidomide embryotoxicity by in vitro embryotoxicity testing based on human iPS cells. J. Pharmacol. Sci., 124, 201–207.
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8) Okubo, Y., Ohtake, F., Igarashi, K., Yasuhiko, Y., Hirabayashi, Y., Saga, Y., & Kanno, J. (2021) Cleaved Delta like 1 intracellular domain regulates neural development via Notch signal-dependent and-independent pathways. Development, 148, dev193664.
9) Uibel, F., Mühleisen, A., Köhle, C., Weimer, M., Stummann, C.T., Bremer, S., & Schwarz, M. (2010) ReProGlo: A new stem cell-based reporter assay aimed to predict embryotoxic potential of drugs and chemicals. Reprod. Toxicol., 30, 103–112.
10) Directive 2010/63/EU of the European parliament and of the council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union.
11) Inoue, A., Nishimura, Y., Matsumoto, N., Umemoto, N., Shimada, Y., Maruyama, T., Kayasuga, K., Morihara, M., Katagi, J., Shiroya, T., et al. (2016) Comparative study of the zebrafish embryonic toxicity test and mouse embryonic stem cell test to screen developmental toxicity of human pharmaceutical drugs. Fundam. Toxicol. Sci., 3, 79–87.
12) Kanno, S., Okubo, Y., Kageyama, T., Kitajima, S., & Fukuda, J. (2022) Establishment of a developmental toxicity assay based on human iPSC reporter to detect FGF signal disruption. iScience, 25, 103770.
13) Kanno, S., Okubo, Y., Kageyama, T., Yan, L., & Fukuda, J. (2022) Integrated fibroblast growth factor signal disruptions in human iPS cells for prediction of teratogenic toxicity of chemicals. J. Biosci. Bioeng., 133, 291–299.
14) Kanno, S., Mizota, K., Okubo, Y., Kageyama, T., Yan, L., & Fukuda, J. (2022) Luciferase assay system to monitor fibroblast growth factor signal disruption in human iPSCs. STAR Protoc., 3, 101439.
