生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

1990年代RNA干渉（RNA interference：RNAi）発見のさきがけとなったペチュニア研究を発端として，植物では多くのsmall RNA研究が進められてきた．近年，長鎖non-coding RNA（lncRNA）も多く同定され，その機能についても注目が集まっているが，植物lncRNAの分子機能に関する知見はいまだ乏しい．

イネやトウモロコシを中心に，700か所を超える非コードゲノム領域から，雄の生殖組織（葯）特異的に発現するlncRNAと，そこから由来する膨大な種類の二次的なsmall RNAが見つかっている．これら二次的なsmall RNAはDicer様タンパク質（Dicer like protein：DCL）により，21塩基ないし24塩基ごとの規則的なプロセシングを受け，21塩基長または24塩基長のフェーズを示すことからphased small interfering RNA（phasiRNA）とも呼ばれている．

これら葯特異的なphasiRNAの生成を抑制した変異イネでは，体細胞からなる葯壁に発生異常が生じ，最終的に花粉（生殖細胞）に影響を及ぼすことから，phasiRNAを介した非細胞自律性制御が葯の発生に重要な役割を果たすことが示唆される．シロイヌナズナのトランンスポゾン由来のsmall RNAは，葯壁のタペート層から生殖細胞に移動することがScience誌に報告され^1），small RNAを介した植物の生殖組織発生分野はホットな領域となりつつある．しかし，植物の生殖組織の非細胞自律性制御の分子メカニズムといった中核部分は未解明である．本稿では，非コードゲノム由来のphasiRNA群のサイレンシングを介した葯の発生機構を中心に植物の生殖システム全貌解明の糸口を探索したい．

phasiRNAは，大きく21塩基と24塩基の長さに分類され，21-PHASまたは24-PHASと名づけられたphasiRNAの前駆体RNAから由来する．PHASの最大の特徴は，22塩基のmicroRNAが認識する共通配列の存在である．興味深いことに，21-PHASの多くは，microRNA2118（miR2118）が認識する共通配列を，また，24-PHASではmicroRNA2275（miR2275）の認識する共通配列を持つ．22塩基のmicroRNAによってPHASが切断されると，この切断が引き金となり，RNA-dependent RNA polymerase 6（RDR6）を介して二本鎖RNAが合成される．さらに，エンドヌクレアーゼをコードするDicer like Proteins（DCLs）により二本鎖RNAがプロセシングを受け，DCL4では21塩基長のphasiRNA，また，DCL3b/5によって24塩基長のphasiRNAが生成される^{2, 3）}（図1）．

図1 植物のphasiRNA生合成経路

単子葉植物では，700種を超える非コードゲノム領域から生殖ステージ特異的にlncRNA（PHASs）が発現する．miR2118/miR2275が認識する22塩基の共通配列内で「生殖lncRNAs」が切断された後，RDR6/DCL4のプロセシングを経て，多種多様な21塩基phasiRNAが生成する．また，DCL3b/5のプロセシングにより24塩基のphasiRNAが生成する．トマトやマメ科作物を含む双子葉植物においても，miR2118は高く保存される．しかし，phasiRNAの前駆体となるRNA（PHAS）はタンパク質をコードする遺伝子群から葉を作る栄養成長期にも発現し，単子葉植物の生殖lncRNAとは異なる．

miR2118の切断が引き金となって生成される21塩基phasiRNAの生合成経路は，被子・裸子植物を含む陸上植物に広く保存されている^2）．一方で，phasiRNAの前駆体となるPHASの種類は，単子葉植物と双子葉植物で大きく異なる．イネやトウモロコシなどのイネ科作物を含む単子葉植物の21-PHASは，700～2000か所の非コードゲノム領域から生殖期特異的に発現するlncRNAとなる．これら生殖特異的なlncRNAは，miR2118が標的とする共通配列を含み，共通配列以外のほとんどはユニークな配列となる^3）．一方，双子葉植物の21-PHASは，タンパク質をコードした転写因子や防御応答に関与する遺伝子群からなる．これらは数十から数百に至る相同性の高いファミリー遺伝子群から構成されている^4）．多様な配列から構成されるPHASsと種を超えて高く保存されるmiR2118/2275の組合わせによって生成される最終産物phasiRNAとは，どのような機能があるのだろうか．

タンパク質やRNAの時空間制御は生殖組織発生に必要不可欠となっている．植物の雄の生殖器官となる雄しべは，主要部分を構成する葯と葯糸からなる．葯は後に花粉となる生殖細胞と，葯壁と称する体細胞層からなり，葯壁によって生殖細胞を包み込こんだ筒状の形をしている^5）（図2A）．葯においても，PHAS/miR2118/miR2275/phasiRNAの時期特異的，かつ，部位特異的な発現パターンが報告されている．始原生殖細胞が発生するステージから，21-PHAS（lncRNA），および，miR2118の発現が上昇し始める．さらに相同染色体の対合が始まる減数分裂前期に入ると，21塩基phasiRNAの発現が上昇する．21塩基phasiRNAの発現に続いて，24塩基phasiRNAの発現が高くなる．phasiRNAの長さによって時期特異的な発現がみられることから，トウモロコシでは21塩基premeiotic phasiRNAと24塩基meiotic phasiRNAとも称される^{6, 7）}．

図2 イネの葯立体構造と3種のRNAサイレンシングによる組織・細胞内空間制御

（A）生殖細胞と体細胞層の識別が可能となるイネの葯3Dイメージング．右上部は葯を示す．葯の内側に位置する花粉（生殖細胞）のシグナルは自家蛍光（マゼンタ）を撮像した．生殖細胞を取り囲む葯壁（体細胞層）をカルコフローで染色した（水色）．スケールバー100 µm．（B）葯特異的に発現するphasiRNAの空間制御機構．AGO1b/dは，ウラシル-phasiRNA（U-phasiRNA）と結合する．AGO1b/dは，U-phasiRNAのモバイルキャリアとして体細胞層から生殖細胞に移動する可能性が示唆された．一方，MEL1-シトシン-phasiRNA（C-phasiRNA）複合体は，花粉母細胞特異的に局在し，標的因子の切断を介したトランス型サイレンシングを引き起こす．3種類のAGOsによる細胞間・細胞内の空間制御が明らかとなった．

small RNAは，Argonaute（AGO）に取り込まれ，これらsmall RNA–AGO複合体が，転写を抑制するサイレンシング機構の中心を担っている．small RNAのサイレンシング機構は，昆虫，動物，植物とさまざまな生物種に保存される．イネゲノムには，19個のAGOファミリー遺伝子群が存在する．21塩基phasiRNAがAGOに取り込まれる過程で，5′末端の塩基がシトシンであるphasiRNA（C-phasiRNAs）は，花粉母細胞（生殖細胞）特異的に機能するAGO（MEL1）に優先的に取り込まれる^8）．一方，5′末端の塩基がウラシルであるphasiRNA（U-phasiRNAs）は，葯壁（体細胞層）の発生にも必要な因子として予測されている．葯壁と花粉母細胞の両者で発現するAGO1bとAGO1dは，U-phasiRNAに結合する^{9, 10）}（図2B）．phasiRNAの1番目の塩基の特異性が，葯の体細胞層／生殖細胞のphasiRNA局在に重要であり，さらに，U-phasiRNAにはAGO1サブグループのAGO1b/dが，C-phasiRNAにはMEL1が結合し，MEL1, AGO1b, AGO1dの3種類のRNAサイレンシングの局在特異性とその組合わせによって葯の発生が制御される．

近年，イネやトウモロコシといった作物を中心に，葯phasiRNAの機能が報告されている．減数分裂期の花粉母細胞を用いたトランスクリプトームやRNAデグラドームの解析により，21塩基のC-phasiRNAはトランスに働き，標的mRNAを切断することが明らかとなった．これら21塩基C-phasiRNAが標的とするmRNAを過剰発現すると減数分裂異常が起きる．このことから，phasiRNAのターゲット切断を介したサイレンシングが，正常な減数分裂の進行に大きく関与していることが示唆される．また，21塩基のC-phasiRNAと結合するMEL1は，主に花粉母細胞の細胞質に局在が観察され，減数分裂レプトテン期の相同染色体対合に必須であることからも，C-phasiRNAのトランス型サイレンシング機能による減数分裂前期の制御が示唆された^{11, 12）}．

一方，U-phasiRNAの生成が減少するmiR2118の変異イネでは，葯壁の細胞伸長の阻害が観察され最終的に花粉の発生に異常がみられ不稔を示す^9）．生殖細胞発生異常や減数分裂停止にみられるmel1の生殖細胞でのみの表現型とも異なっている．U-phasiRNAと結合するAGO1bとAGO1dタンパク質は，葯壁（体細胞層）および，花粉母細胞（生殖細胞）の両者で発現がみられる．一方，AGO1bとAGO1dのmRNAの発現は花粉母細胞で著しく低く，葯壁における強い特異的な発現がみられる．mRNAとタンパク質の局在が異なることから，葯壁で翻訳されたAGO1b/dタンパク質が，U-phasiRNAのモバイルキャリアとして葯壁から花粉母細胞へ移動し発生を制御する可能性も示唆される^10）（図2B）．AGO1b/d–U-phasiRNAは葯壁から体細胞層への動きを持った中での葯全体の発生制御に，一方，MEL1–C-phasiRNAは生殖細胞制御に関与しており，small RNAの葯における機能分化も示唆される．生殖細胞の発生は葯壁の発生と同調しており，葯壁の発生に異常を示す変異体では生殖細胞の発生にも異常がみられる．このことから，長らく非細胞自立性の生殖細胞発生機構が示唆されてきたが，葯壁と生殖細胞との細胞間コミュニケーションやモバイルタンパク質などその分子メカニズムは解明されていない．AGO1b/d–UphasiRNA複合体やmiR2118の葯壁から花粉母細胞への非細胞自律性制御も示唆され，今後の細胞間移行・相互作用の研究展開が期待される．

トウモロコシの24塩基phasiRNAは，減数分裂前期に24-PHASゲノム領域のCHH DNAメチル化に影響を及ぼし，シス作用のサイレンシングが報告されている^13）．興味深いことに，rdr6変異イネでは，21塩基small RNAが減少し，CHH DNAメチル化に影響を及す24塩基small RNAが増幅される．さらに，減数分裂前期の組換えを促す二本鎖切断に異常がみられた^14）．減数分裂は遺伝情報が次世代に受け継がれる重要なライフイベントであることから，phasiRNAと減数分裂をひもづけるエピジェネティックな制御機構は，植物の生殖メカニズムに新たな見識をもたらすと期待される．

phasiRNAの生殖機能において，環境応答との関連も非常に興味深い．移動できない植物にとって，厳しい環境においても生殖組織を正常に発生させ子孫を残す戦略が必要となる．phasiRNAのプロセシングを担うトウモロコシDCL3b/5，トウモロコシMALE-ASSOCIATED ARGONAUTE-1/-2（MAGO1/MAGO2），イネRDR6，および，イネAGO1dの変異体は，温度に依存して葯の発生が異常となり雄性不稔を示す．温度に応答したphasiRNAの機能に加え，mir2118変異イネや21-PHAS遺伝子座に多型が生じたイネでは，一日の日の長さ（日長）に応答して不稔を示す^{7, 9, 15）}．このようにphasiRNAの生合成経路の因子群は，気温や日長に依存した生殖システムと強くリンクしている．環境に応答したphasiRNAの分子機構の解明は，厳しい環境条件下でも安定した収量を確保するための応用研究への展開も期待できる．

植物の雄の生殖器官である葯の発生には，miRNA, phasiRNA, AGOの時空間的な制御が必要不可欠であることが示された．特に，MEL1とC-phasiRNA複合体は生殖細胞の減数分裂前期に，トランス作用のサイレンシングに関与している．一方で，AGO1b/dとU-phasiRNAのサイレンシングの機能はまだ未解明である．しかし，葯壁（体細胞層）と生殖細胞においてAGO1b/dのmRNAとタンパク質との局在が異なること，また，変異体の表現型から洞察するに，非細胞自律型の発生制御への関与が示唆される．AGO-phasiRNAを介した体細胞と生殖細胞間コミュニケーションの分子メカニズム解明にも今後注目したい．

phasiRNAの前駆体となるlncRNAの生殖ステージ一斉の転写制御には，多くの転写因子が関与することも報告されているが^6），in vitroの実験系では，転写因子が直接lncRNAの転写領域に結合することは確認できていない．1000種類を超えるlncRNAの時期特異的な転写制御の仕組みもまた興味深く，phasiRNAの機能解明と並行して，高等生物のゲノムの大部分を占める非コードゲノム領域の役割が明らかになることも期待される．