生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析では，さまざまな反応溶液条件下で標的酵素の構造を決定できる．そのため，多分子系の生化学では解析が難しい酵素の構造変化と触媒過程の対応づけが可能である（構造生化学解析）．特に，動くことで機能するタンパク質の化学・力学共役機構を捉えるのに威力を発揮する．本稿では，回転することで機能するATPase（回転型ATPase）のクライオ電子顕微鏡による構造生化学解析について，筆者らのグループのV/A-ATPaseの研究を例に紹介する．

ATP合成酵素は，F型とV型の2種類のATPaseに大別できる^1–3）．F型ATP合成酵素は，F_oF₁と呼ばれ，ミトコンドリアの内膜やクロロプラストのチラコイド膜，一部の細菌の細胞膜に存在し，生体膜間の電気化学ポテンシャル（プロトン駆動力）を利用して，ADPをリン酸化しATPを合成する．V型のATP合成酵素は，一部の細菌や古細菌の細胞膜に存在し，単にV-ATPaseと呼ばれることもあるが，古細菌（Archaea）に存在することから，V/A-ATPaseもしくはA-ATPaseと呼ばれることもある^4）．原核生物のV/A-ATPaseは，真核生物の酸性オルガネラに存在するプロトンポンプであるV-ATPaseにそっくりで，真核生物のV-ATPaseの先祖型ATPaseと考えられる^2）．

F型とV型のATPaseは，基本構造を共有しており，親水的でATPの合成もしくは加水分解を行うF₁/V₁部分と，プロトンの透過を担う膜内在性のF_o/V_o部分から構成される（図1）．F₁/V₁部分は，ATPの加水分解により中心回転軸を回転させる回転分子モーターであり，F_o/V_o部分は，プロトン駆動力で回転する回転分子モーターである．F₁/V₁とF_o/V_oは，中心回転軸と外周固定子を共有しており，そのため，二つのモーター部分は，回転運動によりATPの合成／加水分解と，プロトン移動を共役させている（図1D）．

図1 F_oF₁（細菌型）およびV/A-ATPaseの基本構造

（A） F_oF₁の構造．F₁部分はα₃β₃γ₁δ₁ε₁から，F_o部分は，a₁b₂c₁₀から構成される．（B） V/A-ATPaseの構造．V₁部分は，A₃B₃D₁F₁から，V_o部分はa₁E₂G₂d₁c₁₂から構成される．（C） V₁部分のスライス構造．A₃B₃の中心を回転軸であるDFが貫いている．（D）回転触媒機構の模式図．中心回転軸が外周固定子部分に対して回転することで，V₁部分でのATPの加水分解／合成と，V_o部分でのプロトン移動が共役する．（E） BoyerのBinding Change Mechanismモデル．

単離されたF₁/V₁ドメインは，ATP加水分解活性を示し，それぞれ，F₁-ATPaseおよびV₁-ATPaseと呼ばれる．F₁/V₁-ATPaseが3分子のATPを加水分解すると，回転子が360°回転するので，一つのATP分子の加水分解あたり，回転軸が120°回転することになる．

約60年前にPaul Boyerは，F_oF₁が回転することで，ATPを合成するとしたBinding Change Mechanism説を唱えた^5）．この説では，ATP合成酵素のF₁ドメイン内の三つの触媒部位が，中心にあるγサブユニットの回転に伴い，ATP/ADPに対する親和性が異なるLoose, Tight, Openの形態を順次とるとしている（図1E）．三つの触媒部位の協同的な構造変化により，ADP＋Piの結合，ADPのリン酸化，合成されたATPの放出が順番に起こる（回転触媒機構）．Boyerによって予測されたF₁ドメインの非対称な六量体構造は，1994年にウシ心筋ミトコンドリアF₁-ATPaseの結晶構造によって確認された^6）．続いて，1分子回転観察実験によってF₁-ATPaseの回転触媒機構が直接証明された^7）．この実験では，回転子のγサブユニットに観察用プローブを取りつけ，固定子であるα₃β₃を，ヒスチジンタグを介してガラス表面に固定した．ATPによるプローブの一方向回転が光学顕微鏡で観察され，F₁-ATPaseがATPによって回転することが証明された．同様に，我々も5年後にV₁-ATPaseの回転を実証した^8）．以来，F₁-ATPaseに関する多くの1分子回転観察実験が行われ，一つのATP分子の結合が120°ステップを引き起こし，それが80°と40°のサブステップに分割され，ATP加水分解が80°の位置で起こることが示されるなど^9），F₁-ATPaseの回転機構に関する理解が深まった．しかし，ATPの加水分解エネルギーが回転力に変換される機構（化学・力学共役機構）については，まだ議論が分かれている．

好熱菌Thermus thermophilusのV/A-ATPaseは，真正細菌で初めて発見されたV型のATPaseであり，ATP合成酵素として機能する^10）．この酵素は非常に安定性が高く，大量調製が可能であるため，構造・機能解析に適しており，最もよく研究されたATP合成酵素の一つである．V₁ドメインは，三つの触媒部位を含むA₃B₃六量体の中心に棒状のDF複合体が貫いており，単離されたV₁ドメインは，ATPを加水分解して回転子であるDFを回転させる（図1）．

V₁-ATPaseの1分子回転観察実験は，F₁-ATPaseとほぼ同じ方法で行われた．その結果，V₁-ATPaseでは，F₁で観察された120°ステップの間にある80°の停止は観察されなかった^11）．このことは，V₁-ATPaseは，120°ごとの停止位置で，ATPの結合とATPの分解が同時に起こることを示す．この結果は，クライオ電子顕微鏡による構造解析により確認された．

クライオ電子顕微鏡による単粒子構造解析は，一つ一つのタンパク質粒子の画像を撮影し，その画像を元に3次元構造を再構成する方法である．その過程で，異なる構造を3次元クラス分けにより分離し，それぞれのクラスに対して構造精密化を進めることができる．このため，構造多型が予想されるタンパク質試料の構造機能解析に有効である．たとえば，回転型ATPaseのように回転状態に対応した複数の構造が混在する場合にも適用できる．酵母V-ATPaseの場合，単粒子解析により中心回転軸の異なる方向を持つ三つのクラスが分離された^12）．また，我々も，単粒子解析を用いてV/A-ATPase試料中に存在する異なる構造をいくつかのクラスに分類し，それぞれのクラスの構造の分解能を向上させることができた^13）．

次に，V/A-ATPaseのATP加水分解中間体の構造を捉えるために，内在性ヌクレオチドを除去したV/A-ATPaseをナノディスクに再構築し，低濃度ATPでATP結合を待つ反応条件，飽和ATP濃度での触媒反応を待つ反応条件，ATPの加水分解を待つ条件で反応させた酵素溶液からクライオグリッドを作製し，クライオ電子顕微鏡で構造解析した^14）．

V₁ドメインの原子分解能構造を得るために，各条件下でV₁部分を強調した構造精密化を行った．触媒部位へのヌクレオチド（ATP/ADP）結合状態にかかわらず，V₁ドメインは，開いた構造（AB_open），やや閉じた構造（AB_semi），閉じた構造（AB_closed）から構成されていた（図1，図2）．

図2 V/A-ATPaseのATPによる回転機構

AB_openにATPが結合すると，120°ステップ待ち構造であるV_3nucになる（上）．三つのABで（a）～（c）の反応が同時進行し，DFが120°ステップする．DFと三つのABとの結合面が決まっているので，ABが構造変化するとDFの位置が変化し，120°ステップする．

飽和ATP濃度条件（［ATP］≫K_m）で得られたV₁ドメインの構造では，AB_openにはATP, AB_semiにはATP, AB_closedにはADPとPiが結合していた（V_3nuc構造）．

ATP結合が律速段階になる条件（［ATP］＜K_m）では，ADPがAB_closedに，ATPがAB_semiに結合していたが，AB_openは空であった（V_2nuc構造）．このことは，次のATP分子がAB_openに結合することを示す．

最後に，加水分解が遅くなるATPアナログであるATPγS（4 mM）を含む反応液中のV₁部分の構造を解析した．この条件では，ATP加水分解を待つ構造（V_prehyd）が得られるはずである．得られたV₁ドメインの構造には，すべての触媒部位にATPγSとADPが観察された．AB_closedにはADP, AB_semiには，ATPγSが結合しており，このことは，AB_closedが加水分解後の構造で，AB_semiが加水分解を待っている構造であることを示す．つまり，AB_semiに結合したATPγSの加水分解には，DFの120°ステップを伴うAB_semiからAB_closedへの構造変化が必要であり，V_prehydが，AB_semi上のATPγSの加水分解を待っている構造になる．

以前のF₁-ATPaseとV₁-ATPaseの1分子回転実験では，120°ステップ（F₁の80°ステップ）がATP結合と同時に起こることが示され，ステップ開始の待ち時間のヒストグラム解析もそれを支持していた．AB_openにATPがすでに結合しているV_3nuc構造の存在は，V₁ドメインへのATP結合と120°ステップが同時に起こるのではなく，結合したATPによって120°ステップが開始されることを示す．

回転中のV/A-ATPaseの構造生化学解析は，ATP加水分解と回転運動との化学力学共役機構に関する重要な洞察を提供する．V_3nucからV_2nucへの構造変化では，図2に示されるように，三つのAB二量体は以下の構造変化を同時に起こす：（a）AB_openからAB_semiへの変化，（b）AB_semiからAB_closedへの変化，（c）AB_closedからAB_openへの変化．これらの変化と同時にDF回転子が120°ステップする．（a）では，結合したATPによりAB二量体がより閉じた構造になる．また，AB_semi（ATP）とAB_closed（ADP＋Pi）を比較すると，結合しているATPとADPの違いによりダウンヒルの化学ポテンシャル差が生じている．そのことにより，AB_semiからAB_closedへの構造変化が自発的に起こり，同時に120°ステップも駆動される．AB_closedに結合したADPおよびPiが放出され，AB_openに変換する過程（c）は，触媒部位とADP＋Piとの相互作用を切断する過程であり，120°ステップによりAB_closedが開くことにより引き起こされる．

つまり，三つの触媒部位で起こる化学反応が，軸タンパク質の120°ステップと共役することで同時に起こる．AB_openに結合したATPに加えて，AB_semiに結合したATPの加水分解過程も，120°ステップの駆動力になる．

クライオ電子顕微鏡による構造解析では，反応時間を変えることで，酵素の反応の進行に伴う構造変化を捉えることも可能である．しかし，酵素の速い構造変化を捉えるには工夫がいる．我々は，V/A-ATPase初期反応を遅くする硫酸イオンを反応液に加えることで，初期状態から定常状態への変化を遅くした^15）．まず，低濃度のATPと硫酸イオンを含むV/A-ATPaseの反応液を60秒間反応させ，クライオグリッドを作製し構造解析した．この条件では，AB_semiとAB_closedに硫酸イオンが結合し，AB_openが空の構造（V_2SO4）と，AB_semiにATP, AB_closedに硫酸イオン，AB_openが空の構造（V_semi1ATP）が得られた（図3A）．V_semi1ATPは，V_2SO4のAB_openにATPが結合し，120°ステップした後の構造である（図3A下）．次に，V/A-ATPaseを飽和濃度のATPで5秒および30秒反応させ，構造解析した（図3B, C）．5秒の反応溶液からは，AB_openの触媒部位にATPが結合し，AB_closedおよびAB_semiの両方に硫酸塩が結合した構造（V_1ATP）と，AB_openとAB_semiの触媒部位にそれぞれATPが結合し，AB_closedに硫酸イオンが結合した構造（V_2ATP）が得られた．V_1ATPは，V_2SO4にATPが結合した直後の構造であり，V_2ATPは，V_semi1ATPのAB_openにATPが結合した直後の構造と考えられる．飽和ATP濃度条件でV/A-ATPaseを30秒反応させた反応液からは，V_1ATPと，AB_openとAB_semiにATPが結合し，AB_closedにおそらくADP＋Piが結合した構造（V_3ATP）が得られた．この構造は，以前の研究で，飽和ATP条件下で得られたV_3nucに相当する．

図3 V/A-ATPaseの時間分解能構造解析

（A～C）異なる反応条件と時間で得られたV₁部分の構造．（D）初期状態から定常状態への構造変化．この実験では，V_2nucは構造として単離されず半透明で表示した．

V_2SO4からV_3nucへの移行過程を，図3Dに示した．まず，V_2SO4にATPが結合すると，V_1ATPができる．AB_openに結合したATPにより，V_1ATPが120°ステップし，AB_closedの硫酸イオンが放出され，V_semi1ATPになる．V_semi1ATPにATPが結合すると，V_2ATPになる．これが120°ステップすると，AB_closedからADPとPiが放出され，V_2nucに変化する．V_2nucにATPが結合すると，V_3nucになる．ここまでくると，最初にV₁部分に結合していた硫酸イオンはすべて放出され，V_2nucとV_3nucが交互に現れる定常状態になる．この結果から，硫酸イオンがV/A-ATPaseの初期反応を遅くする一方，定常状態での活性に影響を与えないことがうまく説明された．

V/A-ATPaseを30秒間ATP飽和条件で反応させた溶液にも，V_1ATPが存在した（図3C）．AB_openに結合したATPによる120°ステップが速い過程であれば，30秒の反応時間でV_1ATPは消失しているはずである．また，同じ反応液からV_2ATPが確認されなかったことから，V_2ATPが120°ステップしてV_2nucに変化する過程がより速いことが示唆される．すなわち，AB_openにATPが結合しているだけの状態よりも，AB_openとAB_semiの両方にATPが結合している方が，より速く120°ステップが起きることがわかる．つまり，AB_semiに結合したATPも120°ステップの駆動力の一つになる．これは，先述したモデルと一致しており，結合したATPによってAB_openが閉じることと，AB_semiでのATPの加水分解過程の両方が協同して120°ステップを引き起こし，同時にAB_closedを開いてADPとPiが放出される．

クライオ電子顕微鏡による構造生化学解析は，酵素の機能を解明する上で強力な手法である．現在，クライオ電子顕微鏡のマシンタイムに制限があるが，今後クライオ電子顕微鏡の台数が増え，気軽に誰でも使えるようになれば，より多くの酵素の機能が構造生化学により解明されるであろう．結晶構造解析では捉えにくい中間体構造を数多く決定することができ，酵素の高機能改変やドラックデザインなどの産業応用も期待される．