生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

動物には外部環境から身を守るバリア，たとえば皮膚の表皮において病原体や化学物質の侵入および乾燥を防ぐ透過性バリア（皮膚バリア）や眼球表面を覆う涙液による涙液バリアなどが存在する．脂質の三大機能として生体膜形成，エネルギー源，および脂質メディエーターが広く知られているが，脂質はバリア機能にも重要であり，皮膚バリアではセラミド，涙液バリアではコレステリルエステルやワックスエステルなどが関与する^{1, 2）}．これらの脂質は表皮や涙液に限局して存在しているわけではなく，生体のさまざまな組織に分布している．しかし，表皮や涙液にはバリア形成に特化した長い炭素鎖を有する分子種が存在し，バリア機能に必須の役割を果たす^{3, 4）}．口腔粘膜にも透過性バリア（口腔バリア）が存在するが，バリア機能に関与する脂質は不明であった．本稿では口腔粘膜における長い炭素鎖を有するセラミドの存在とその口腔バリア機能への関与について，筆者らの最近の報告を交えて紹介する^5）．

セラミドはスフィンゴ脂質の基本骨格を形成する脂質分子であり，長鎖塩基と脂肪酸がアミド結合した構造を持つ（図1A）．動物のセラミドを構成する長鎖塩基と脂肪酸には複数のタイプが存在し，長鎖塩基には五つのタイプ（ジヒドロスフィンゴシン，スフィンゴシン，フィトスフィンゴシン，6-水酸化スフィンゴシン，スフィンガジエン），脂肪酸には六つのタイプ（非水酸化脂肪酸，α-水酸化脂肪酸，β-水酸化脂肪酸，ω-水酸化脂肪酸，エステル化ω-水酸化脂肪酸，タンパク質結合ω-水酸化脂肪酸）が存在する^6）．これらの組合わせによってセラミドは理論的には30クラスから構成される（図1B）．各クラスのセラミドは脂肪酸と長鎖塩基の略号で表記され，たとえばNSクラスは非水酸化脂肪酸（N）とスフィンゴシン（S）からなるセラミドを示す．脂肪酸や長鎖塩基のタイプは動物種によって異なることがあり，長鎖塩基のHタイプ（6-水酸化スフィンゴシン）はヒトの角質層には存在するが，マウスでは検出されていない^6）．逆に，脂肪酸のBタイプ（β-水酸化脂肪酸）はマウスの角質層には存在するが，ヒトでは検出されていない^6）．セラミドを構成する脂肪酸は基本的に飽和あるいは一価不飽和脂肪酸である．炭素鎖長はタイプによって異なり，N, A, BタイプがC16～C28であるのに対し，O, EO, P-OタイプはC30～C36の長い炭素鎖を有する．また，長鎖塩基にも主要なC18に加えて異なる炭素鎖長（C16～C26）を有するものが存在する^7）．したがって，各クラスのセラミドはこれらの違いを持つ多数の分子種から構成される．筆者の所属する研究室では，液体クロマトグラフィー連結タンデム質量分析法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry：LC-MS/MS）を用いてこれらの分子種を区別して検出・定量可能な分析法を確立し，ヒト角質層セラミドの包括的な分析を行った結果，23クラス，計1581分子種が存在することを報告している^7）．

図1 セラミドの構造と分類，アシルセラミドの合成経路

（A）セラミドの構造およびセラミドを構成する長鎖塩基と脂肪酸の種類．（B）セラミドクラスの略記表．（C）アシルセラミド合成経路を構成する反応と酵素．文献5より一部改変．

EOタイプの脂肪酸を持つセラミドはω-O-アシルセラミド（アシルセラミド）と呼ばれ，Oタイプのセラミドのω-水酸基にリノール酸がエステル結合した構造を持つ（図1C）．アシルセラミドの合成には，（1）C30～C36の長い炭素鎖を有する脂肪酸の合成に関わる脂肪酸伸長酵素elongation of very-long-chain fatty acid 1（ELOVL1）とELOVL4, （2）C30～C36脂肪酸のω位を水酸化し，Oタイプの脂肪酸を合成するcytochrome P450 family 4 subfamily F member 22（CYP4F22），（3）Oタイプの脂肪酸にCoAを付加するfatty acid transport protein 4（FATP4）（別名SLC27A4），（4）OタイプのアシルCoAと長鎖塩基を基質としてOタイプのセラミドを合成するセラミド合成酵素ceramide synthase 3（CERS3），（5）トリアシルグリセロールのリノール酸をOタイプのセラミドに転移させ，アシルセラミドを合成する酵素patatin-like phospholipase domain-containing 1（PNPLA1）と活性化因子abhydrolase domain-containing 5（ABHD5）が関与する（図1C）^{8, 9）}．合成されたアシルセラミドはグルコシル化，細胞外への放出，および脱グルコシル化を経てアシルセラミドに戻り，角質細胞間に存在する脂質ラメラの形成と維持に重要な役割を果たす．P-Oタイプの脂肪酸を持つセラミドはタンパク質結合型セラミド（結合型セラミド）と呼ばれ，アシルセラミドのリノール酸（C18:2）に含まれる二重結合の過酸化に始まる一連の修飾を含む一部未解明の機構によってアシルセラミドから産生する^8）．結合型セラミドは角質細胞の周辺帯と呼ばれるタンパク質の架橋構造体に共有結合して角質細胞脂質エンベロープを形成し，死細胞である角質細胞を形質膜に代わって被覆するとともに，脂質ラメラを角質細胞間に保持する役割を果たすと考えられている．これまでに同定されたアシルセラミドあるいは結合型セラミドの生合成に関わる酵素の遺伝子変異はいずれも角質層の肥厚と皮膚バリア障害を特徴とする先天性魚鱗癬を引き起こす^10）．

筆者らは口腔に始まる消化管のバリア機能に関与する脂質に関心を持ち，特にセラミドに着目して研究を行った．野生型マウスの口腔粘膜（頬と舌）と食道，胃，小腸，および大腸から脂質を抽出し，炭素鎖長C18の長鎖塩基を持つセラミドのLC-MS/MSによる包括的解析を行った結果，口腔粘膜，食道，および胃にSタイプの長鎖塩基を持つアシルセラミド（EOS）と結合型セラミド（P-OS）が存在することを明らかにした（図2A, B）．一方，小腸と大腸ではこれらのセラミドは検出されなかった．アシルセラミドと結合型セラミド以外のセラミドは各組織に10クラス程度存在し，全体としてセラミドプロファイルは口腔粘膜，食道，および胃からなるグループと小腸および大腸からなるグループに大別された（図2C, D）．マウスの口腔粘膜，食道，および胃の一部は表皮と同じ重層扁平上皮を含む点で共通しており，アシルセラミドと結合型セラミドが重層扁平上皮に広く存在することが示唆された．

図2 口腔粘膜のセラミドプロファイル

（A, B）野生型マウスの口腔粘膜（頬，舌），食道，胃，小腸，大腸におけるアシルセラミド（A）と結合型セラミド（B）の定量値．（C, D）野生型マウスの舌粘膜（C）と小腸（D）における遊離型セラミド（非結合型セラミド）クラスの定量値．（E, F）ヒトの口腔粘膜（頬，歯茎）におけるアシルセラミド（E）と結合型セラミド（F）の定量値．（G, H）野生型マウスの舌粘膜（G）とヒトの口腔粘膜（頬，歯茎）（H）のアシルセラミド（EOSクラス）を構成するω-O-アシル鎖の組成．#は検出限界未満を示す．文献5より一部改変．

マウス口腔粘膜におけるアシルセラミドと結合型セラミドの存在を受けて，ヒトの口腔粘膜についてもセラミドの包括的な分析を行った．マウスの口腔粘膜は全体が角化しているが，ヒトの口腔粘膜には角化している部位としていない部位が存在する．そこで，角化している歯茎の付着歯肉と角化していない頬の粘膜を綿棒で擦って採取し，セラミドプロファイルを調べた．その結果，歯茎の粘膜にはアシルセラミドと結合型セラミドの両方が存在していること，頬の粘膜にはアシルセラミドのみが存在し，結合型セラミドは存在していないことが明らかになった（図2E, F）．また，予想外の結果として，歯茎の粘膜には表皮にみられるHタイプのセラミド（NH, AH, EOH, P-OH）が存在していたのに対し，頬の粘膜にはこれらが存在していなかった．このことから，結合型セラミドおよびHタイプのセラミドの産生と角化との関連が示唆された．本研究により，ヒト口腔粘膜の詳細なセラミドプロファイルとその部位による違いが初めて明らかになった．

アシルセラミドと結合型セラミドに関する報告のほとんどは表皮についてのものであるが，ブタやヒトの口腔粘膜における存在が1980年代から2000年代にかけて報告されている^11–14）．これらの報告は主として薄層クロマトグラフィーによる分析に基づいているため，分子種の詳細は不明である．しかし，ブタにおいて，アシルセラミドのω-O-アシル鎖が表皮ではリノール酸が主要であるのに対し，口腔粘膜では飽和のステアリン酸（C18:0）とパルミチン酸（C16:0）が主要であり，二つで合計75％を占めると報告されている^14）．結合型セラミドの合成にはアシルセラミドのリノール酸に含まれる二重結合の修飾が必要なため，飽和のω-O-アシル鎖を持つアシルセラミドからは結合型セラミドが合成できない．筆者らがマウスとヒト口腔粘膜のアシルセラミドについてω-O-アシル鎖の組成を調べたところ，いずれにおいてもリノール酸が80％以上を占めていた（図2G, H）．したがって，マウスとヒトの口腔粘膜の結合型セラミドは表皮と同様にω-O-アシル鎖にリノール酸を持つアシルセラミドから合成されると考えられる．

口腔バリアにおけるアシルセラミドと結合型セラミドの役割を明らかにするため，アシルセラミドの合成に必要な脂肪酸伸長酵素ELOVL1のノックアウト（knockout：KO）マウスを解析した．以前，筆者らは全身型のElovl1 KOマウスが表皮のアシルセラミド合成不全を示すことを報告したが^3），全身型Elovl1 KOマウスは皮膚バリア不全によって新生致死となる．これを回避するため，口腔と食道の粘膜上皮特異的にCreを発現するED-L2-Creマウスを用いてElovl1コンディショナルKOマウス（Elovl1 cKOマウス）を作製した．Elovl1 cKOマウスの口腔粘膜と食道ではアシルセラミドと結合型セラミドの量がコントロールマウスの約3分の1以下に減少していた．その他のセラミドクラスについては，ELOVL1が産生に関わる炭素鎖長C24およびC26の脂肪酸を持つセラミドが減少し，炭素鎖長C20およびC22の脂肪酸を持つセラミドが増加しており，セラミドの脂肪酸部分が短鎖化していた．セラミドの総量はほぼ変化していなかった．

口腔粘膜と食道の組織学的解析の結果，Elovl1 cKOマウスの舌において魚鱗癬様の角質層の肥厚とその下部の顆粒層と有棘層における細胞密度の増加がみられた（図3A）．また，Elovl1 cKOマウスの食道では粘膜上皮の波状の凹凸が平坦化していた．舌粘膜の透過性バリア機能を蛍光色素の浸透度で評価した結果，Elovl1 cKOマウスでは蛍光色素がコントロールよりも深くまで浸透し，バリア機能が低下していた（図3B, C）．さらに，口腔バリア機能を行動学的に評価するため，辛味をもたらすカプサイシン入りの水を与えて飲水量を測定した．コントロールマウスではカプサイシン入りの水を飲む量が普通の水よりもやや減少し，カプサイシンに対する軽度の忌避性がみられたのに対し，Elovl1 cKOマウスでは飲水量が大きく減少し，重度の忌避性がみられた（図3D）．以上の結果より，口腔粘膜に存在するアシルセラミドと結合型セラミドは口腔バリア機能に重要であることが示唆された．

図3 脂肪酸伸長酵素ELOVL1のノックアウトマウスにおける口腔バリア不全

（A）コントロールマウス（左）とElovl1 cKOマウス（右）の舌切片のヘマトキシリン・エオシン染色像．（B）コントロールマウス（左）とElovl1 cKOマウス（右）の舌における色素（緑色）の浸透度を示す蛍光画像．青色は細胞核を示す．（C）（B）の黄色い枠で囲まれた領域の蛍光強度．（D）水またはカプサイシンを含む水を与えられたコントロールマウスとElovl1 cKOマウスの飲水量．*P＜0.05, **P＜0.01. 文献5より一部改変．

筆者らの研究により，口腔バリア機能へのアシルセラミド・結合型セラミド依存性透過性バリアの寄与が明らかになった^5）．ELOVL1に変異を持つ先天性魚鱗鱗患者において口腔内の乾燥と食物を飲み込む際の痛みが報告されている^15）．この患者においてElovl1 cKOマウスと類似したセラミドの組成変化と口腔バリア機能低下が起こっていることが推測され，アシルセラミドと結合型セラミドがヒトの口腔バリアにも関与する可能性を示唆しているが，さらなる解析が必要である．また，ヒト口腔粘膜の角化している部分としていない部分の間で明確なセラミドプロファイルの違いがみられた．この違いを生み出す機構の解明も新たな課題としてあげられる．今後，口腔バリアの理解が深まり，口腔疾患の予防法や治療薬の開発につながることが期待される．