生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

Gタンパク質共役受容体（G-protein-coupled receptor：GPCR）は，臨床薬の約1/3，ヒトのホルモンのおおよそ1/2の標的となっており，神経伝達などの重要な生理機能を制御している．動物の視覚などを担う光受容体オプシンは，ビタミンAの誘導体であるレチナール（図1A）を発色団として結合する光感受性GPCRであり，class-A GPCRファミリーに属する．かつては，オプシンと他の受容体はまったく別のタンパク質と考えられていたが，GPCR遺伝子がクローニングされると，オプシンがGPCRファミリーの一員であることが明らかになった．

図1 動物オプシンとGPCR

（A）オプシンの発色団分子レチナールの化学構造．（B） GPCRのアミノ酸残基の表記法．GPCRの模式図（一般のGPCRに合わせて細胞外側を上側に示した）と各膜貫通ヘリックスにおいて「基準」となるアミノ酸残基を左側に，ウシロドプシン残基番号とBallesteros-Weinstein/GPCRdb numbering systemにおける，それぞれの基準アミノ酸残基の表記法を右側に示した．GPCRが活性化されると，GαとGβγ，アレスチン（arrestin）がそれぞれ細胞内シグナル伝達経路を駆動して複雑な細胞応答を引き起こす．本稿では，Gタンパク質経路とアレスチン経路のいずれかを選択的に駆動するツールをバイアスツール，Gα経路とGβγ経路のいずれかを選択的に駆動するツールを精密バイアスツールと呼ぶ．

このような歴史があるため，オプシンと他のGPCRでは「文化」に若干の違いがある．たとえばオプシンの構造を示す際は細胞質側を上向きにするのが主流であるが，他のGPCRでは細胞外側を上にすることが多い（図1B参照）^1）．アミノ酸残基の表記法にも違いがあり，GPCRでは各膜貫通ヘリックスにおける最も保存度の高いアミノ酸残基番号を“50”として，ヘリックス番号とともに表記するBallesteros-Weinstein/GPCRdb numbering system^2）が標準であるが，オプシンでは最も研究が進んでいるウシの桿体視細胞で機能するオプシン（ウシロドプシン）の残基番号で表すことが慣例となっている．表記法による混乱を避けられるよう，図1BにBallesteros-Weinstein/GPCRdb numbering systemとウシロドプシン残基番号との対応を示す．

動物オプシンは光依存的に三量体Gタンパク質を活性化するGPCRであるため，光遺伝学（オプトジェネティクス）解析においてGタンパク質経路およびアレスチン経路を光で操作するツールとして利用されている^3）．動物オプシンを光操作ツールとして利用すると，細胞内シグナル伝達経路を介して光シグナルの増幅が行われるため，チャネルロドプシンを用いた場合と比べて，100倍以上弱い光でも細胞応答を引き起こすことができる^4）．そのため動物オプシンを用いた「GPCR光遺伝学」は，刺激光が届きにくい深部組織や大型器官，大型動物に適すると考えられる．

三量体Gタンパク質はαサブユニット（G α）の種類によってGs, Gq, Gi/o, G12の4種に大別され，Gsと共役するオプシン（変異体）は細胞内cAMPの上昇，Gq共役オプシンは細胞内Ca^2＋の上昇を起こす「興奮性」操作に，Gi/o共役オプシンは，cAMPの減少あるいはGタンパク質βγサブユニット（Gβγ）によるイオンチャネルの制御による「抑制性」操作に用いられる^3）．また，光依存的にG12を活性化できるオプシン変異体が報告されている^5）．これらの中で，Gi/o共役オプシンを用いた抑制性操作が最もよく行われており，その用途には脊椎動物の視細胞で機能するオプシン（視物質と呼ばれる）が用いられてきた^4）．しかし脊椎動物の視物質は，光によって活性化しかできず（光でオフできない），網膜以外の組織にはあまり存在しないシス型のレチナール（図1A）の供給が必要という難点がある．この難点は，異なる波長の光によってオンとオフの両方の反応を起こすことができ，広範な組織に含まれるトランス型のレチナール（図1A）も結合できるオプシンをツールとすることで解決できる．このようなオプシンは脊椎動物の眼外光受容器官や無脊椎動物から見いだされており，その中で最もよく利用されているのが大阪公立大学の寺北・小柳らがヤツメウナギの松果体・副松果体から見いだしたGi/o共役オプシンのパラピノプシン（LamPP）である^6）．LamPPは，紫外光刺激で活性化，可視光刺激で不活性化できる光操作ツールとして利用されている．LamPPの光依存的なオン・オフ反応は，図2Aに示したスキームで説明できる．

図2 Gβγ精密バイアスツールとして機能するc-opsin1のシグナル伝達特性

（A） LamPPとc-opsin1の光反応およびGタンパク質活性化スキーム．詳細は本文を参照．（B） LamPP，c-opsin1，c-opsin1/RGS8融合タンパク質による，Gβγを介した光依存的なGIRKチャネルの電流応答．これらの電気生理応答はアフリカツメガエル卵母細胞を用いて測定した．（C） LamPP（黒），c-opsin1（赤），c-opsin1/RGS8融合タンパク質（青）による，Gi/oαを介したアデニル酸シクラーゼの抑制によって生じる二次メッセンジャー（cAMP）応答．哺乳類培養細胞における細胞内cAMP濃度の増減を，発光cAMPセンサーを用いて測定した．cAMPレベルの低下を感度よく捉えるために，フォルスコリンを事前に添加して，アデニル酸シクラーゼを活性化して測定した．（D）光刺激後持続的にGi/oを活性化するLamPP（黒）と，一過的に活性化するc-opsin1（赤）の，Gタンパク質活性化能の経時変化モデル．光刺激後速く起こるGIRKの活性化についてはGタンパク質活性化のピーク値によって規定され，遅く起こる二次メッセンジャー応答については活性化の時間積分値によって規定されると考えられる（本文参照）．そのため，自己不活性化が起きるc-opsin1では，GIRK応答の大きさはLamPPとあまり変わらないが，cAMP応答は非常に小さくなる．ただし，光刺激を続けるとc-opsin1は活性化され続けるためcAMP応答は大きくなる（パネルC参照）．（E）野生型と異なり光刺激後持続的にGi/oを活性化するc-opsin1 K94T変異体のGIRK応答とcAMP応答．パネルA，B，C，Eは，文献8の図を改変したものである．

前述したように，動物オプシンを光操作ツールとして用いるGPCR光遺伝学の利点としては高い光感度があるが，GαやGβγ，アレスチンを介して（図1B）複雑な細胞応答が起きるため，何を操作しているのかが不明確になることが難点となる．加えて，光刺激で生じる応答の時間分解能が利点にも難点にもなりうる．

動物オプシンは下流のシグナル分子を介して間接的に細胞応答を引き起こすため，たとえばチャネルロドプシンを用いて数百Hz（あるいはそれ以上）の頻度ですばやく活動電位をコントロールするようなことはできない．その一方で，動物オプシンは光刺激を止めても細胞応答が持続する特性があり，とりわけLamPPは紫外光刺激後，数十分以上細胞応答を持続できる^6）．チャネルロドプシン由来の抑制性光操作ツールでは，光刺激後に応答が長時間持続するものが少ない（が日々改良されている^7））ため，光照射を続けることによる悪影響を最小化できることも動物オプシンの利点となる．ただしオプシンの種類によっては，光刺激後速やかに細胞応答が減衰するため，一過的にGタンパク質を活性化するものもあり，その場合ツールとしてのよさが「台なし」のように思える．しかし，本稿ではこのような一過性のGタンパク質活性化を示すオプシンを利用して，GPCRが駆動するシグナル経路のうちGβγ由来の応答を選択的に駆動できる「精密バイアス光操作ツール」（図1B）を開発した研究を紹介する^8）．

筆者らは，環形動物ゴカイ（Platynereis dumerilii）幼生の脳内光受容細胞で機能するオプシンであるc-opsin1^9）が，紫外光依存的にGi/oを活性化し，可視光刺激によって不活性化されることを2017年に報告した^10）．このオプシンはトランス型のレチナールも結合できるため，光反応とレチナールの結合特性はLamPPと類似していた．一方で，LamPPは紫外光刺激を止めてもGi/oを活性化し続けるが，c-opsin1は紫外光刺激を止めるとGi/oの活性化が減衰する（図2B）．つまりc-opsin1の反応スキームは図2Aのように捉えられ，光非依存的な（時間依存的な）自己不活性化プロセスを持つと考えられた．

2017年の論文^10）では，Gi/oの活性化を，Gi/oαから解離したGβγによって活性化されるK^＋チャネルのGIRK（G protein-coupled inwardly rectifying potassium channel）を透過する電流量変化として測っていた（図2B）．今回，c-opsin1によるGi/oの活性化をGi/oαによるアデニル酸シクラーゼの抑制，すなわち細胞内cAMPレベルの低下によって測定すると，LamPPよりも小さな応答しか生じないことを見いだした．具体的には，短時間（10秒）の光照射では小さなcAMP応答が生じ，長時間（数分）の照射では，一過的に大きな応答が出たのち速やかにその応答が減衰した（図2C）．このようなc-opsin1が示す特徴的な細胞応答は，以下のように解釈することで理解できた．

一般的に，Gi/oα由来の二次メッセンジャー（cAMP）応答は酵素反応で数十秒から数分オーダーで起こる．一方，Gβγによるイオンチャネル制御（電流応答）は数百ミリ秒から数秒のオーダーで起こりGPCRが介する応答の中では最速レベルである^11）．そのため，c-opsin1の光刺激後のGタンパク質活性化能の時間変化を図2Dのようなものだと考えると，遅いcAMP応答の大きさは活性化能の時間積分値が主に規定し，速いGIRK応答の大きさは活性化能のピーク値が主に規定すると考えられた．そのためにc-opsin1を短時間光刺激すると，速いGIRK応答は十分引き起こせるが，遅いcAMP応答はあまり引き起こさない，と想定できた．この考えは，長時間の紫外光刺激によってc-opsin1を活性化し続けると，大きなcAMP応答が一過的に生じること（図2C）や，光刺激を止めても継続的にGタンパク質を活性化するようになるc-opsin1のK94T変異体ではcAMP応答も大きくなる（図2E）ことで確認できた．

以上の結果から，光刺激に伴い一過性のGタンパク質活性化を起こすc-opsin1を，Gi/oα由来の応答をあまり起こさない「Gβγバイアス特性」を持つ光操作ツールとして活用できるのではないかと考えた．この「Gβγバイアス特性」をより明確にするために，c-opsin1によるGi/o活性化をさらに一過的にする機能改変に取り組んだ．

Gi/oの一過的活性化を「強化」するために，c-opsin1にシグナル伝達調節タンパク質を融合することを考えた．具体的にはGi/oの不活性化すなわちGTP加水分解反応を加速するRGS8をc-opsin1のC末端に融合させた．作製したc-opsin1/RGS8融合コンストラクトでは，期待したとおりにGβγによるGIRK活性化のオフキネティクスが4倍程度速くなった（図2B）．そしてGi/oαによるcAMPレベルの光依存的な低下については，もとのc-opsin1単体よりもさらに小さくなることが確認できた（図2C）．つまり，RGS8をc-opsin1に融合させることで，「Gβγバイアス」特性を強化することができた．これまで筆者らが試してきたオプシン類およびそれらの変異体の中では，このc-opsin1/RGS8が最もGβγバイアス性が高い．

3節で述べたように，GPCRが複数のシグナル経路を駆動することは，動物オプシンを光操作ツールとして用いた際の難点になることがある．同様の難点はGPCRを標的とした薬理作用の解析や，人工リガンドにのみ応答する変異GPCRを用いた化学遺伝学（ケモジェネティクス）解析^12）にもあてはまる．つまり，GPCRの機能解析やGPCRを細胞操作ツールとして用いる解析において，GPCRが駆動するシグナル経路を「切り分ける」ことが重要である．この切り分けのために，これまでにGタンパク質あるいはアレスチンのどちらか一方のみを選択的に駆動する薬剤および操作ツールが開発され，それらはバイアスリガンドやバイアスツールと呼ばれる^{13, 14）}．

バイアスリガンドの代表としては，副作用の少ない鎮痛剤の候補であるμオピオイド受容体のGタンパク質経路のみを駆動するリガンドがあり^13），バイアスツールの例としては，ウシロドプシンとβ2アドレナリン受容体のキメラ変異体のOpto-β2AR^LYYが光依存的にアレスチン経路を，Opto-β2AR^SSがGタンパク質経路を選択的に駆動する^14）．Gタンパク質経路はGα経路とGβγ経路に分かれるため，これらの経路をさらに切り分ける“精密”バイアスツール（図1B）が必要となるが，これまで報告されてこなかった．1 : 1の量比で解離したGαとGβγがそれぞれシグナル伝達することを考えると，このような切り分けはできないと考えられてきたのかもしれない．しかし，筆者らの研究から，Gα経路とGβγ経路のキネティクスの違いを利用してGβγ経路の精密バイアスツールを作ることができた．ほぼ同時期に，異なる発想でGβγ経路を選択的に駆動する光操作ツールも報告されている^15）．今後はGPCR下流のシグナル経路のうち，特定のシグナル経路のみを操作できるさまざまな精密バイアスツールの開発が進むことで，GPCR光遺伝学の難点が克服されていくことが期待される．