生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

酸化ストレスはがんや動脈硬化，糖尿病，肝炎などの幅広い疾患の発症に関与することが報告されている．そのため，生体内においては酸化ストレスによる有害なダメージから自らを保護するためにさまざまな生体防御システムが存在する．たとえば，抗酸化物質は酸化的な障害を引き起こす分子を中和することで，その作用を抑制し，生体を酸化ストレスから保護する．生体内抗酸化物質として，システイン（CysSH）やグルタチオン（GSH）などのチオール（–SH）基を有する化合物や硫化水素（H₂S）が以前より知られているが，近年これらの化合物にさらに硫黄原子が付加したシステインパースルフィド（CysSSH）やグルタチオンパースルフィド（GSSH），二硫化水素（H₂H₂）などの超硫黄分子が生体内に普遍的に存在することが明らかとなり，新規の抗酸化物質として注目を浴びている^{1, 2）}．CysSSHやGSSH, H₂H₂は硫黄付加により，その抗酸化力／還元性は母化合物であるCysSHやGSH, H₂Sと比べて非常に高い^{3, 4）}．そのため，超硫黄分子は酸化ストレス制御に重要な役割を担っていることが考えられている．生体内における超硫黄分子産生酵素として，シスタチオニンγ-リアーゼ（cystathionine γ-lyase：CSE）やシスタチオニンβ-合成酵素（cystathionine β-synthase：CBS）が知られており，これらの酵素はシスチン（CysSSCys）を基質とした際にはCysSSHを，CysSHを基質とした場合にはH₂Sを産生する^{3, 5）}．さらには，システイニルtRNA合成酵素2（cysteinyl-tRNA synthetase 2：CARS2）はCysSHを基質としてCysSSHの産生を行うことが報告されている^6）．また，これらの酵素反応はピリドキサール5′-リン酸（pyridoxal 5′-phosphate：PLP）要求性であることも明らかとなっている^{5, 6）}．さらに，酵素反応により産生されたCysSSHは自身の有するサルフェン硫黄（sulfane sulfur；六つの価電子からなる0価のS原子）をグルタチオンやタンパク質のチオール基に受け渡し，GSSHの形成やタンパク質チオール基のポリスルフィド化に寄与するため，生体内では超硫黄分子は多様な形で存在する^{7, 8）}．

腸管は硫黄代謝が盛んに行われている臓器の一つであり，食事由来の有機硫黄化合物，たとえば含硫アミノ酸などのうち20～25％は腸管において代謝を受ける^9）．腸管内では40兆個もの腸内細菌が宿主と共生して腸内細菌叢を形成しており，腸管での硫黄代謝に腸内細菌の関与が報告されている．たとえば，Desulfovibrio属に代表される硫酸還元菌は硫酸塩を還元し，H₂Sを産生する^10）．また，Salmonella属であるSalmonella enterica serovar Typhimurium（Salmonella Typhimurium）は自ら産生したCysSSHを利用し，宿主の防御機構の一つである，マクロファージによるオートファジーから逃れることが近年報告されている^11）．最近の研究により，腸内細菌が産生する代謝物が，腸管内外の生理機能に関連しており，腸内細菌の影響は，腸管を超えて全身性に及ぶことが明らかにされている．しかし，腸内細菌が産生する超硫黄分子を含む硫黄代謝物が，宿主の腸管外の臓器に及ぼす影響については十分に研究されていない．本稿では，腸内細菌による宿主酸化ストレス制御に関わる硫黄代謝物について，最近の我々の研究成果を基に概説する．

我々ははじめに，腸内細菌による宿主生体内の超硫黄分子レベルへの影響を評価するため，SPFマウス（SPFマウス群）とアンピシリンとバンコマイシンの抗菌剤混合投与により腸内細菌を除去したマウス（抗菌剤投与群）における血漿中の超硫黄分子濃度の比較を行った．その結果，抗菌剤投与群ではSPF群と比較してH₂Sに加えて，超硫黄分子であるCysSSH, GSSH濃度が有意に低下していた．さらに，腸内細菌を持たない無菌（germ-free：GF）マウスと，GFマウスに腸内細菌を定着させたexGFマウスの血漿中超硫黄分子濃度を比較した結果，exGFマウスで有意に超硫黄分子濃度が上昇していた（図1A）．以上の結果より，腸内細菌は宿主に超硫黄分子を供給していることが示された．次に，腸内細菌が直接的に超硫黄分子を産生しているかを検討した．哺乳類の細胞において，CysSSHはCysSSCysやCysSHを基質にしてCBSやCSE, CARS2などの酵素によって産生されることが明らかとなっている．そこでまず，糞便をメチオニン（Met），CysSH, CysSSCysの3種類の含硫アミノ酸と培養し，上清中の超硫黄分子濃度の比較を行った．その結果，CysSSH濃度は，CysSSCysを添加した場合に最も増加することが確認された．以上の結果より，腸内細菌は主にCysSSCysを基質として超硫黄分子を産生することが示唆された．次に，上記の超硫黄分子産生が腸内細菌によるものかを検討するため，水を投与したマウス（コントロール群）と抗菌剤を投与したマウス（抗菌剤投与群）の糞便から，それぞれ5 kDa以上の高分子画分を抽出し，CysSSCysと反応させた．その結果，コントロール群の画分を反応させた場合には，CysSSHが産生されたのに対して，抗菌剤投与群の画分を反応させた場合にはCysSSHはほとんど産生されなかった．以上より，腸内細菌由来の成分中にCysSSCysを基質としてCysSSHを産生する酵素が存在することが示唆された．さらに，in vivoにおいてもCysSSCysを基質とした超硫黄分子の産生が腸内細菌によって起こるかどうかを検討した．その結果，コントロール群と比較して，CysSSCysを投与したマウス群では血漿中のH₂S, CysSSHやGSSH濃度が有意に増加した（図1B）．なお，CysSHやGSHの濃度はCysSSCysの投与によって変化しなかった．一方で，CysSSCys投与による血漿中でのこれら超硫黄分子の濃度上昇は，抗菌剤投与群では観察されなかった（図1B）．以上の結果より，CysSSCysを基質として腸内細菌により産生された超硫黄分子は，腸管で吸収された後に，血液循環を通して宿主側へ移行している可能性が示された．また，少なくともCysSSCysを摂取した場合の生体内の超硫黄分子量の増加は，生体内に取り込まれたCysSSCysあるいはその代謝物を基質とした合成ではなく，腸内細菌叢におけるCysSSCysを基質とした産生・供給が主要な役割を担っていることが示唆された．

図1 腸内細菌による超硫黄分子産生と宿主の抗酸化能への寄与

（A）GFマウス，exGFマウス，SPFマウスの血漿中のCysSSHとGSSHレベル．（B）水（cont）または抗菌剤溶液（Abx）を自由飲水させたマウスにCysSSCysを経口投与した際の血漿中CysSSH濃度．（C）各マウスに15 mg/kgのConcanavalin A（ConA）を静脈投与し，12時間後の肝臓中のMDA値．（D）腸内細菌叢は新たな超硫黄分子の供給源であり，宿主の抗酸化能の向上に寄与している．Uchiyama, J., Akiyama, M., Hase, K., Kumagai, Y., & Kim, Y.G. （2022） Cell Rep., 38, 110479の図を改変して引用．

超硫黄分子は強力な抗酸化能を有する生体内抗酸化物質である．そのため，腸内細菌由来の超硫黄分子が宿主の抗酸化能を増強させている可能性がある．上記の可能性を検証するため，酸化ストレス性病態モデルとして知られているコンカナバリンA（Concanavalin A：ConA）誘導性肝炎モデルを用いた^12）．マウスにConAを静脈投与し，血清と肝臓組織のサンプリングを行った．HE染色により肝障害の程度を組織学的に評価し，ConA単独投与群（コントロール群）において広範囲の壊死巣を確認した．また，肝障害マーカーである血清中アラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase：ALT）値はConA投与により，コントロール群において有意に増加した．一方で，CysSSCys投与群では壊死巣の縮小が観察され，血清中ALT値の増加も有意に抑制された．さらに，肝臓における酸化ストレスの指標として，マロンジアルデヒド（malondialdehyde：MDA）の定量を行った．その結果，ConA投与による肝臓中でのMDAの蓄積も同様に，コントロール群と比較して，CysSSCys投与群において有意に抑制された（図1C）．ところが，CysSSCys投与による肝障害抑制効果は抗菌剤投与条件下では確認されなかった．以上の結果より，CysSSCysの投与は酸化ストレス性の肝炎病態を軽減するが，この肝障害抑制効果は腸内細菌依存的であることが示唆された．そこで次に，上記の肝障害抑制効果が超硫黄分子によるものかを検討するため，超硫黄分子のドナーである四硫化ナトリウム（sodium tetrasulfide：Na₂S₄）を用いて，血漿中での超硫黄分子濃度の増加による肝障害抑制効果を調べた．Na₂S₄は自身の有するサルフェン硫黄をCysSHやGSHに受け渡すことにより，超硫黄分子を生成する．実際に，Na₂S₄の腹腔内投与2時間後では，抗菌剤投与（腸内細菌）の有無にかかわらずNa₂S₄投与群において血漿中の超硫黄分子濃度の有意な増加が確認された．続いて，Na₂S₄投与による，ConA誘導性肝炎における肝障害抑制効果を検討した．その結果，コントロール群と比較してNa₂S₄投与群において血清中ALT値，肝臓中のMDAの蓄積が抑制されることが確認された．さらに，抗菌剤投与条件下においても，Na₂S₄の腹腔内投与によって血漿中超硫黄分子を増加させた場合には，肝障害が抑制されることが確認された．以上の結果より，腸内細菌によって産生された超硫黄分子は全身性に宿主側へ移行し，宿主における抗酸化ストレス能の強化に寄与することが示唆された（図1D）．

続いて超硫黄分子を高産生する腸内細菌の探索を行った．水（対照群）または，異なる抗菌スペクトラムを有する抗菌剤であるバンコマイシン，ストレプトマイシン，エリスロマイシンを自由飲水にてマウスに投与し，腸内細菌叢の組成の変化が糞便中超硫黄分子濃度に与える影響について評価した．その結果，エリスロマイシン投与群ではCysSSCysを投与した際に，糞便中超硫黄分子濃度が顕著に増加することを確認した．さらに，16S rRNA遺伝子解析法にて，各抗菌剤を投与した際の腸内細菌叢の組成を解析した．エリスロマイシン投与群では他の群と比較してLachnospiraceae科とRuminococcaceae科の割合が有意に高く，これらの科に属する腸内細菌が超硫黄分子を産生している可能性が高いと考えられた．そこで，上記腸内細菌科の細菌を含む多様な腸内細菌株を用いて，in vitroでCysSSCysを添加した際の培養上清中の超硫黄分子濃度を測定し，超硫黄分子産生能を比較した．その結果，予想されたように，Ruminococcaceae科，Lachinospiraceae科に属する細菌は高い超硫黄分子産生能を有することが確認された（図2A）．さらに，高い超硫黄分子産生能を有するAnaerotruncus colihominis（A. colihominis），Clostridium bolteae（C. bolteae），Dorea longicatena（D. longicatena）は，超硫黄分子産生を行う際にCysSSCysを主要基質として用いることも明らかとなった．また，これらの菌から抽出したタンパク質とCysSSCysを反応させた場合にCysSSHの産生が行われることも確認した（図2B）．一方で，Bacteroidaceae科に属するBacteroides thetaiotaomicron（B. thetaiotaomicron）から抽出したタンパク質では，CysSSCysを基質とした超硫黄分子の産生は確認されなかった．これらの結果から，A. colihominis, C. bolteae, D. longicatenaはCysSSCysを基質とする超硫黄分子の産生酵素を有することが示された．哺乳類の生体内においてCysSSCysから超硫黄分子を産生する主要酵素であるCSE, CBSはPLP依存的であることが明らかとなっている．そこで，細菌が有する超硫黄分子産生に関与する酵素も同様の性質を有するか検討するために，PLP依存的な酵素反応を阻害するアミノオキシ酢酸（aminooxyacetic acid：AOAA）添加による超硫黄分子産生の阻害効果を確認した．その結果，超硫黄分子高産生菌であるA. colihominis, C. bolteae, D. longicatenaから抽出したタンパク質による超硫黄分子産生はAOAA添加によって阻害されることが確認された（図2B）．一方で，B. thetaiotaomicronの場合にはAOAA添加による影響を受けないことが示された．これらの結果より，CysSSH高産生性の腸内細菌が保有する酵素はPLP要求性であることが示された（図2C）．

図2 CysSSH高産生菌の同定

（A）嫌気条件下において，各細菌株とCysSSCys（1 mM）を添加した溶液を37°Cで30分間培養後の培養上清中CysSSH濃度．（B）AOAA存在下あるいは非存在下において，各細菌株から抽出した高分子区画（10 kDa以上）をCysSSCys（1 mM）と反応させた反応溶液中のCysSSH濃度．（C）Ruminococcaceae科，Lachinospiraceae科を含む特定の細菌はPLP依存的な酵素反応によりCysSSCysからCysSSHを高産生する．Uchiyama, J., Akiyama, M., Hase, K., Kumagai, Y., & Kim, Y.G. （2022） Cell Rep., 38, 110479の図を改変して引用．

我々は腸内細菌による宿主への酸化ストレス制御超硫黄分子の宿主への供給とその抗酸化能の増強に，腸内細菌叢が果たす役割を明らかにした．腸内細菌由来の超硫黄分子産生酵素はまだ同定されていないが，我々は腸内細菌がCysSSCysを基質としてCysSSHを産生すること，この過程には少なくともPLP依存性酵素が関与していることを示している．さらに，超硫黄分子の供与体や超硫黄分子産生酵素を導入したトランスジェニックマウスを用いたいくつかの研究から，超硫硫黄分子が非アルコール性脂肪性肝疾患，アテローム性動脈硬化症，神経疾患などの他の慢性疾患の抑制に寄与することが示されている^{13, 14）}．したがって，腸内細菌叢由来の超硫黄分子は，これらの疾患に対する保護作用も有する可能性がある．

近年のさまざまな研究により，腸内細菌叢はさまざまな全身疾患を制御していることが示されている．メカニズム的には，腸内細菌が短鎖脂肪酸，分岐鎖アミノ酸，芳香族アミノ酸，トリメチルアミン，二次胆汁酸などのさまざまな代謝産物を産生し，それらが宿主に吸収されて全身を循環することで，宿主の生理機能や疾患制御に影響を与えると考えられている．我々は，腸内細菌叢由来の代謝産物が宿主の抗酸化能強化に寄与する新たなメカニズムを提唱した．また，我々の結果は，食物繊維などによってRuminococcaceae科，Lachinospiraceae科を含む特定の細菌の存在量を増加させる戦略が，宿主の酸化ストレスを制御するために利用できる可能性を示している．

一方で，超硫黄分子は，直接的な抗酸化作用に加えて，分子内の硫黄原子に可動性があり，タンパク質チオール（–SH）基へのポリスルフィド化を介して，タンパク質の品質管理やシグナル伝達など多彩な細胞機能の制御に関わる^15）．これらの知見を考慮すると，腸内細菌が産生する超硫黄分子は宿主だけでなく，腸内細菌自身の菌体内機能にも重要な役割を持つと予想される．実際，我々は宿主臓器と同様に腸内細菌タンパク質のSH基が硫黄化修飾されている事実を発見している．現在，腸内細菌がなぜ超硫黄分子を産生しているのか，その生理的意義の解明に向け研究に取り組んでいる．