生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

生体防御の要である獲得免疫応答の基本原理は自己と非自己の識別であり，分子生物学的手法の助けを借りて，T細胞やB細胞の詳細な役割が次々と明らかになった．一方，制御性T（Treg）細胞を中心とした免疫寛容誘導は，過剰な応答を抑制することでパウル・エールリヒが「自己中毒忌避（horror autotoxicus）」と呼んだ自己に対する攻撃の回避にほぼ成功しているが，その一方でわずかに残る自己反応性細胞が引き起こす自己免疫疾患は，いまだに多くの人々を苦しめている．免疫学は基礎科学とされるが，新型コロナウイルスとの戦いをみてもその応用科学的な側面を軽視することはできず，自己免疫疾患の克服もその中に含まれる．自己免疫疾患の治療法自体は以前より格段に進歩しており，サイトカインや免疫細胞を標的とした新しいバイオ製剤の有効性が示されているが，その一方でいまだに多くの自己免疫疾患の第一選択薬となっているステロイドの発見に対してノーベル賞が贈られたのは，70年以上も前のことである．自己免疫疾患の多くは重篤な病態を伴うことから根治療法の開発が渇望されているが，究極の治療法ともいえる抗原特異的自己免疫寛容誘導については，発症に関わる自己抗原の全体像が不明なままであるため，実用化の先行きを見通すことは難しい．本稿では，高い実用性が期待される自己反応性T細胞を標的としたまったく新しい自己免疫疾患の精密医療の可能性を，我々の最近の成果を含めて概説する（図1）．

図1 自己免疫疾患の精密医療とは

自己免疫疾患の治療法は，副作用が強い方法から，より特異性が高い方法へと移行している．自己反応性Th細胞を標的とするアプローチは，特異性と副作用のバランスを兼ね備えた理想的な治療法を提供しうる．

多発性硬化症（MS）は中枢神経系（CNS）に生じる自己免疫疾患であり，T細胞はMS治療薬の標的に含まれる．一方，全身性ループスエリテマトーデス（SLE）などの多くの自己免疫疾患では，ここにB細胞や自己抗体がさらに加わる．特にIgGクラスの自己抗体を産生するB細胞の分化は，同一の自己抗原を認識するT細胞のヘルプを必要とする．自己反応性のヘルパーT（Th）細胞が自己由来のタンパク質を自己抗原として認識して初めて自己免疫反応が惹起されることから，自己反応性T細胞はほぼすべての自己免疫疾患の発症の元凶となる．T細胞は抗原と自己免疫応答をつなぐ唯一のゲートウェイであり，T細胞受容体（T cell receptor：TCR）の構造からの抗原の探索が試みられている．ところがヒトのT細胞のTCRレパトアの多様性は10¹⁸種類程度にも達し，さらに1分子のTCRが認識するペプチドは1000種類にも及ぶとされる．TCR側のアミノ酸配列から抗原ペプチドの配列にたどり着くことはできない上，ヒトの場合主要組織適合性抗原（MHC）の多様性も考慮する必要がある．したがって特定のペプチド抗原が自己免疫病態を引き起こすかどうかは容易にわかる一方で，個々の自己免疫疾患患者の発症に関わる自己抗原の全体像は現在に至るまで不明である．

我々は以前に，MS患者と健常人の末梢血T細胞のDNAマイクロアレイ解析から，患者T細胞で発現亢進する遺伝子としてNR4A2（muclear receptor 4A2）を同定した^1）．さらにMSの動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）マウスでは，NR4A2がTh17細胞に限局して発現すること^2），T細胞特異的NR4A2欠損（NR4A2cKO）によりEAE病態が顕著に改善し，同時にCNS内Th細胞のインターロイキン17（IL-17）産生が低下することなどを明らかにした^3）．興味深いことに，通常低値に保たれるマウス末梢血Th細胞のNR4A2発現は，自己抗原への曝露により顕著に増加する一方で，外来抗原の免疫時には変化しないことから（未発表データ），我々はNR4A2がTh細胞の自己反応性を制御する可能性を想定し，この仮説の検証を行った．

自己免疫性の脳脊髄炎であるEAEは，C57BL/6マウスにミエリンの構成成分であるMOG（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）のペプチド断片（MOG_35–55ペプチド）を免疫することで誘導できる．EAEでは単一のMOGペプチドの免疫によって自己免疫病態が生じることから，MOGペプチド特異的なTCRを発現する自己反応性Th細胞が存在することは明白である．一方，単一のモデル抗原とTCRトランスジェニックマウスなどの組合わせで発展してきた自己反応性Th細胞の反応^4）を，自己抗原全体に対する反応へと拡張することは難しく，「自己反応性Th細胞」^5）という言葉はいまだ観念的である．我々はより広範な自己反応性Th細胞の挙動を調べるために，多様な自己抗原が関わる自然発症型の自己免疫疾患モデルとしてSLEに着目し，T細胞に明確な異常がないBXSB-Yaaマウス背景のNR4A2cKO（BXSB）マウスを樹立した．BXSB-Yaaマウスは，TLR7（Toll-like receptor 7）遺伝子を含むゲノム領域の重複により雄で発症が加速され，二次リンパ臓器の肥大，抗核抗体を含むIgGの産生増加，抗原抗体複合体の蓄積による腎臓障害などを生じるがNR4A2cKO（BXSB）マウスでは上記の所見がいずれも著しく改善した．すなわち同マウスでは，未知抗原を含む多様な自己抗原に対する免疫応答が全般的に抑制されており，NR4A2がTh17細胞以外の自己反応性Th細胞の機能制御を通じて，B細胞や自己抗原が主体の自己免疫疾患の病態にも関わることを強く示唆する結果が得られた．

一般に抗体産生細胞の分化には，ICOS（induced costimulator）/PD-1（programmed death-1）両陽性の濾胞ヘルパーT（Tfh）細胞や末梢性ヘルパーT（Tph）細胞が必要とされる．NR4A2cKO（BXSB）マウスのTfh細胞とTph細胞は，いずれも対照マウスと比較して有意に減少していた．特にTph細胞の低下がより顕著であり，さらにB細胞分化に重要なIL-21産生も減少していた．一方，同マウスにモデル抗原NP-KLHを免疫した後の血中抗NP抗体価（IgG1/IgG2a）は，体細胞超変異（somatic hypermutation）前後の低親和性／高親和性抗体の産生を含めて変動せず，胚中心形成も対照マウスと同程度に認められた．以上の結果から，BXSB-YaaマウスのT細胞特異的なNR4A2遺伝子の欠損により，自己免疫応答が減弱する一方で，外来抗原に対する液性免疫応答は保たれることが示された．

ヒトおよびマウスの自己反応性T細胞について知られている数少ない客観的な指標の一つに，TCRのCDR3領域内の6, 7番目のアミノ酸（P6-7）の疎水性インデックスがあり，これが高いT細胞は自己反応性が亢進し，低いと抑制性であることが示されている^6）．自己反応性細胞を多く含むとされるTreg細胞^7）や腸管上皮細胞間リンパ球（IELs）も高い疎水性インデックスを持つことから，信頼できる指標といえる．NR4A2cKOマウスと対照マウスのTh細胞を比較すると，TCRレパトアの多様性と頻度に差はなかったが，NR4A2cKOマウスでは対照マウスに出現する疎水性インデックスが高いTh細胞の頻度が有意に低下していた．一方，P6-7に親水性アミノ酸を持つTh細胞の頻度には差がないことから，NR4A2cKOマウスでは選択的な自己反応性Th細胞の頻度低下が生じていることが示された．

核内のNR4A2発現やTCRのアミノ酸配列を生細胞で直接検出することできないため，我々は生きた自己反応性Th細胞の識別を可能にする表面抗原（サロゲートマーカー）の探索を行った．その結果，発症後の対照マウスで増加するNrp-1（Neuropilin-1）/PD-1両陽性のTh細胞サブセットが，NR4A2cKOマウスで顕著に減少することを見いだした．Nrp-1はマウスTreg細胞に高発現するが，両系統間でNrp-1陽性Treg細胞の頻度には差がなかった．興味深いことに同細胞は，正常C57BL/6マウスにはほとんど存在しない一方で，Aire欠損マウスやMRL/lprマウスなど自己免疫疾患を自然発症するマウス系統で有意に増加していた．さらにBXSB-Yaaマウス由来のNrp-1/PD-1陽性細胞を移入するとSLE様病態が誘導されたことから，同細胞が病原性細胞であることが確認された．同細胞はSLE患者末梢血でも有意な増加が確認され，ヒトの自己免疫疾患においても類似の挙動を示す興味深い細胞集団であることが示された．Nrp-1は新型コロナウイルスSARS-CoV2の細胞内侵入の補助因子であり，結合したリガンドは細胞内に取り込まれる．この性質を利用したNrp-1陽性がんに対するミサイル療法の開発が進められ，Nrp-1結合性の環状iRGDペプチドなどが開発されている^8）．そこで我々も，Nrp-1結合配列とアポトーシス誘導配列を連結させた合成ペプチドを作製してBXSB-Yaaマウスに投与したところ，SLE様病態が一様に改善し，Nrp-1/PD-1陽性Th細胞も著しく減少することがわかった．以上の結果から，BXSB-Yaaマウスで顕著に増加するNrp-1/PD-1陽性Th細胞は（おそらくNR4A2依存性の）自己反応性Th細胞サブセットであり，同細胞を標的とした治療によりSLE様病態が改善することが示された^9）（図2）．

図2 NR4A2依存性が異なる2種類のTh細胞サブセット

NR4A2依存性の自己反応性Th細胞は，Nrp-1陽性で自己抗体を産生する抗体産生細胞を誘導する．外来抗原に対する液性免疫応答とは異なる細胞集団が関与する．

NR4A2は，リガンド非依存性，転写依存性に機能を発揮する核内受容体分子の一つであり，このNR4Aファミリー分子は，TCRシグナルを制御することで胸腺細胞の選択に関わるとされる^10）．特にNR4Aファミリー分子は，強いTCRシグナルを介した転写因子Foxp3（forkhead box P3）の誘導によってTreg細胞の分化を制御する．ところが胸腺細胞ではNR4A1とNR4A3が発現する一方でNR4A2はほとんど検出されず，NR4A1とNR4A3のダブル欠損マウスでTreg細胞がほぼ消失することから^11），Treg細胞分化へのNR4A2の寄与は大きくないと思われ，胸腺のT細胞分化におけるNR4A2の役割は不明であった．アゴニスト選択性で自己反応性細胞を含むTreg細胞は，少なくともマウスでは大部分がNrp-1陽性であり^12），これらの細胞は自己反応性を保ったまま胸腺外に移行する^13）．興味深いことにTreg細胞の少なくとも一部は，慢性炎症環境下でエフェクターT細胞へと転換することが示されており^14），今回我々が報告したNrp-1陽性のエフェクターTh細胞との関係に興味が持たれる．その際，特にNR4Aファミリー分子を欠損したマウスは，TCRシグナルの反応強度がシフトし，抗原特異性が大きく変化することから，TCRレパトアを含めた詳細な解析を行う必要がある．NR4A2cKOマウスと対照マウスとのNrp-1陽性Th細胞とTreg細胞のTCRレパトアを，自己反応性の観点から丁寧に調べていくことで，NR4A2の真の機能が明らかになることが期待される．

我々の研究から，Nrp-1がエフェクターTh細胞の自己反応性を示す選択的マーカー分子であることが明らかとなり，初めて自己反応性Th細胞を生きたまま捉えるのに必要十分なサロゲートマーカーが得られた．今回の結果から，Th細胞の自己反応性は，特定強度の自己抗原との反応性，CDR3領域の疎水性アミノ酸の選択的利用，およびNR4A2への依存性と密接に関連することが示されたが，“自己反応性”，“NR4A2依存性”，“Nrp-1陽性”の三つの特徴で識別されるTh細胞の異同はいまだ不明であり，今後シングルセルRNA-Seqなどを用いて明らかにしていく必要がある（図3）．“Nrp-1陽性”という自己反応性Th細胞の特徴は，少なくとも動物種や自己免疫疾患の壁を超えて保たれ，Th17細胞やTfh/Tph細胞などのエフェクター機能に依存しない可能性が高いことから，自己反応性Th細胞を標的とする自己免疫疾患の新しい精密医療の実現は，症例数が少なく発症機序が未解明の中枢神経系のさまざまな自己免疫疾患に対する福音となることが期待される．自己免疫疾患に対する新しいクラスの精密医療の実現を目指して，引き続き研究を進めていきたいと考えている．

図3 真の自己反応性Th細胞はどこにいるか？

「自己反応性」，「NR4A2依存性細胞」および「Nrp-1陽性」のTh細胞は，それぞれ大部分が重なる集団と考えられ，TCRレパトア解析を通じた全体像の解明が期待される．