生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

ゲノム編集を発展させるきっかけになったCRISPR-Cas9のヒト細胞への適応^1）が報告されたのは2013年である．ここ10年ほどで，より効率よく，かつ正確にゲノム編集を行うためにCRISPR-Casシステムの多様性の解析が進み，さまざまなCasエフェクターが同定されてきた．一つの触媒部位により二本鎖両方の切断を引き起こすCas12, RNAを標的とするCas13，より広範囲のDNA欠損を誘導するCas3などである^2）．この試みの中で我々はCas9とCas12の進化的起源が原核生物のトランスポゾンであるIS200/IS605にコードされるタンパク質であるIscB, IsrB, TnpBにあることを明らかにし，これらプログラム可能なRNA誘導性DNA切断酵素をOMEGA（obligate mobile element–guided activity）タンパク質と命名した^{3, 4）}．OMEGAタンパク質はCasエフェクターに比べて小さいため，アデノ随伴ウイルスのような遺伝子治療用ベクターに組み込みやすいという利点があり，そのDNA切断機構を知るための構造解析^5–9）が精力的に行われている．このように多様なゲノム編集用酵素が見つかってきたものの，そのすべては原核生物由来であり，真核生物もプログラム可能なRNA誘導性DNA切断酵素を備えているかどうかは最大の謎であった．

カビやアメーバのような真核単細胞生物のトランスポゾン上にも，Cas12の祖先であるTnpB^{3, 4）}と相同なタンパク質が存在していることが2013年にBaoらによって報告されており，Fanzor（Fz）と命名されていた^10）．当時はTnpBのOMEGAとしてのRNA誘導性DNA切断活性は知られておらず，FzはDNAメチル基転移酵素のようなエピジェネティックな酵素活性によりトランスポゾンの転移を制御しているのではないかと議論されていた^10）．OMEGAシステムの解析を通じて，FzがTnpB同様の機能を持つと仮説を立てた我々は，実際にFzがRNA誘導性DNA切断酵素であることを確認し，2023年に報告した^11）．同年にさらに二つのグループよりFzに関する論文^{12, 13）}が発表され，10年間機能未知であったFzは真核生物初のCRISPR-Cas様酵素として一躍注目されることとなった．

本稿では筆者らによるFzのRNA誘導性DNA切断活性の発見と，その機能解析^11）を中心に概説する．

FzはTnpBとの類似性によりOMEGAタンパク質であると推定された．OMEGAタンパク質は，自身のコードされたトランスポゾンの末端逆位配列（terminal inverted repeat：TIR）に由来するωRNAをガイドRNAとして利用してDNAを切断する^3）．Baoらの研究^10）では，Fz遺伝子座におけるωRNAの発現に言及されていなかったため，RNAシーケンスを用いてωRNAの同定を試みた．Fzをそのゲノムに持つ生物の中から，培養可能で，かつRNAの発現解析に適したものとして，ツボカビSpizellomyces punctatusに着目した．報告されていたFzオルソログの多くが真核生物特有のイントロン配列により分断されており，かつ，TIRも進化の過程で失われていることも多く，ωRNAをコードした領域の推定は困難をきわめたが，S. punctatusのFzはイントロンを持っておらず，配列がよく保存されたTIRに挟まれる形で存在していた．Fzはより大きなFanzor1（Fz1）と，TnpBにより類似しているFanzor2（Fz2）に分類される^10）が，S. punctatusはそのゲノム中に19コピーのFz1を有していた（以下，SpuFz1と記す）．S. punctatusの全RNAに対するRNAシーケンスにより，そのうち4コピーのSpuFz1遺伝子下流のTIRに短いRNAの発現を確認した．興味深いことにそれらは同じ5′配列を持ち，TIRにあたる配列とそれに続く14あるいは15ヌクレオチドからなる約90ヌクレオチドのRNAであった．

ツボカビS. punctatusにおいて見つかった約90ヌクレオチドのRNAが実際にωRNAであるかどうか調べるため，カビのモデル生物である出芽酵母を用いて，SpuFz1遺伝子をその下流領域も含む形で発現させ，SpuFz1とωRNAの複合体の精製を試みた．酵母より精製されたSpuFz1はS. punctatusにて内在性に発現していたものと同じRNAと結合していた，すなわちSpuFz1はその下流に存在するωRNAとリボ核タンパク質（ribonucleoprotein：RNP）複合体を作ることが示された．次に，酵母の発現ベクターにおいてガイド配列と想定される部分を任意の配列で置き換え，その配列に一致する標的配列を持つDNA断片を切断できるかどうかin vitroでの実験を行った．これにより，SpuFz1のDNA切断活性を確認し，その切断はωRNA，標的配列依存的であることがわかった．また，その切断には標的配列5′側に標的近接モチーフ（target-adjacent motif：TAM）配列としてCATAが必要であることもわかった．すなわち，SpuFz1はCas9のようなプログラム可能なRNA誘導性DNA切断酵素であることが明らかになった（図1）．

図1 Fanzorの遺伝子座と作用機序

Fanzorは真核生物のトランスポゾン内に存在し，そのタンパク質は下流領域に由来するωRNAと結合し，特定の標的近接モチーフ（target-adjacent motif：TAM）配列とそれに続く標的配列へと誘導され，DNA二本鎖切断を引き起こす．標的配列はトランスポゾンの末端逆位配列（TIR）に隣接する15～20ヌクレオチド程度の配列に対応している．

Fzの多様性を解析するため，報告されていたFzと類似の構造を持つ真核生物タンパク質を，AlphaFold2による推定構造をもとにマイニングした．これらのFz RNPを酵母において発現，精製し活性測定を行った．その結果，SpuFz1以外のFz RNPもωRNA誘導性DNA切断活性を持つことが確認できた．驚くべきことに，多細胞生物であり，ここボストンの名産であるクラムチャウダーに用いられる，ホンビノス貝（Mercenaria Mercenaria）もDNA切断活性のあるFz2（MmeFz2）を持っていることが明らかになった．TAM配列および標的部位の切断パターンはFzオルソログによってさまざまであった（表1）．

次にFzのヒトゲノム編集ツールとしての応用可能性について調べた．精製タンパク質を用いたin vitroのDNA切断実験によって活性が確認された四つのFzオルソログをヒト細胞株HEK293FTに発現させ，同時にヒトゲノム上の遺伝子座を標的としてプログラムしたωRNAを発現させた後に，標的部位において，DNA切断の指標となるインデル（insertion and/or deletion：indel）形成を調べた．これにより，SpuFz1に加えて，二つのFz2オルソログ（MmeFz2, NlovFz2）がヒト培養細胞においてゲノム編集活性を持つことがわかった．さらにSpuFz1に着目し，そのヒト培養細胞における活性の改善を試みた．Cas12において，アルギニンやリシン，そしてヒスチジンのような正に帯電するアミノ酸残基を導入し，負に帯電したCRISPR RNAや標的DNAとの相互作用を強めることで切断効率を上昇させる方法がしばし用いられる．そこで，SpuFz1にR/K/Hを点変異で導入し，111種類の点変異体を試すことで，最大でインデル形成効率を2倍程度に上昇させる点変異を5か所同定した．次にそれら五つを組み合わせた計31種類の変異体を試した．野生型では平均2.7％程度のインデル形成効率であったが，3か所に変異を導入したC310R/D487K/T513K変異体において，その効率が12の遺伝子座で平均11.7％程度まで上昇し，ある遺伝子座では18.4％を達成した．このように，Fzをヒトゲノム編集ツールとして用いることができると示された．

さらに，FzがωRNA，標的DNAとどのように相互作用するかを調べるために，その三者複合体の構造をクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）により2.7 Åの解像度で決定した．Cas12^14）同様，Recドメイン（認識ドメイン）を含むローブと，触媒活性部位を含むローブの二つが標的DNAを囲う構造であった．また，興味深いことにωRNAの40～70番目のヌクレオチドはSpuFz1と相互作用をしていないことがわかった．そこで該当する部位を欠失させたところ，予測したようにSpuFz1のDNA切断活性に影響を与えることなく，ωRNAを67ヌクレオチドまで短縮することができた．さらに，祖先であるTnpBの構造^9）と比較すると，SpuFz1のRecドメインとDNA切断を担うRuvCドメインはより大きく，ωRNAとの相互作用を介してωRNAと標的DNAとの会合部位をより広範囲で保護していることがわかった（図2）．SpuFz1の触媒部位はωRNAによって安定化されているようであり，DNA切断機構それ自体にωRNAが関わっている可能性も示唆された．

図2 Fanzor1とTnpBの構造比較

SpuFz1-ωRNA-標的DNAのcryo-EM構造モデル（PDB: 8GKH）とISDra2 TnpB-ωRNA-標的DNAのcryo-EM構造モデル（PDB: 8H1J）の比較（文献11より改変）．各ドメイン名を対応する色で記載．

筆者らの研究により，Fzの酵素活性について解明されたものの，その生物学的意義はいまだ不明である．原核生物のOMEGAタンパク質IscB, TnpBは，DNA二本鎖切断を介して相同組換えを促すことで，自身をコードするトランスポゾンの複製を助ける^{4, 15）}と報告されている．Bao^10），そしてJiang^12）らはFzをコードするトランスポゾンやFz遺伝子近傍に存在する転移酵素に関しての詳細な解析を行い，Tc1/MarinerやHelitronなど転移機構の互いに異なる多種多様なトランスポゾンがFzと関連して存在することを明らかにした．原核生物においてIS200/IS605とIS607トランスポゾンの転移酵素とのみ共存していたTnpBに対し，真核生物において多様なトランスポゾンとFzが関連しているのは興味深く，TnpB以上に普遍的にトランスポゾンの複製を助ける機能が推測される．一方で，我々が機能解析したSpuFz1のように，TIRで囲まれた遺伝子座に転移酵素との共存がみられないFzも存在するため，別の生物学的意義を併せ持つ可能性も否定できない．由来する生物種により異なる性質を持つ（表1）可能性もあるため，より多くのFzオルソログの解析が必要であろう．

生物学的意義の解明に加えて，TnpBが真核生物にてFzへと進化した過程の詳細な理解も望まれる．たとえば，YoonらはIS607に属する活性残基の再編成されたTnpBがFz2を経てFz1へと進化したとするモデルを提唱している^13）．一部のCas12やTnpBは標的DNAを認識すると，標的に加えて一本鎖DNAを配列とは無関係に切断するコラテラル活性を持っているが，活性残基の再編成されたTnpBではコラテラル活性がみられない^12）．今まで報告されているFz1あるいはFz2についてもコラテラル活性が確認されておらず^{11, 12）}，このFzの進化モデルを裏づけている．イントロンの存在に支持されるように，真核生物特有の遺伝子発現機構に適応した痕跡もみられ，Fzが真核生物の進化に貢献した可能性も示唆される．軟体動物や昆虫からもFzが同定されている^{11, 13）}が，さらに高等な生物もFzを備えているのだろうか？　さらには，IscBやIsrBなど他の原核生物OMEGAタンパク質も真核生物へと移り，独自の進化を遂げたのだろうか？　こうした疑問に答えるべく，真核生物におけるRNA誘導性DNA切断酵素の探索が活発になることを願う．