生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

多細胞生物は器官や組織から成り立ち，それらの形成には，機能的に分化した多様な細胞接着構造が必要である．よって，細胞接着の形成や細胞接着が果たしている機能の分子機構の解明は，多細胞生物の生命現象を理解するために不可欠である．神経細胞が他の神経細胞や筋細胞などと形成し，情報伝達を行う場である化学シナプス（以下シナプス）もまた，そのような細胞接着構造の一つである．シナプスに局在する分子の理解は今世紀初頭より急速に進んでいるが，シナプスの形成や機能の分子機構にはいまだ不明な点が多い．筆者らは，シナプス結合の近傍にある接着装置の一種，パンクタアドヘレンシア結合（puncta adherentia junction：PAJ）に着目し，接着結合裏打ち分子のアファディンを中心に，シナプスの形成と機能の分子機構の研究を行ってきた．本稿では，これらの筆者らの研究成果を中心に概説する．

消化管上皮や神経組織といった上皮組織を形成する上皮細胞は，複数の接着装置で結合して組織や器官特異的な機能を発現している．接着装置の一つである接着結合は，他の接着装置の形成基盤としても働くため，その分子構成や形成の機構の解明は特に重要である．接着結合に限局して局在するアファディン（遺伝子シンボル：Afdn）は線維状アクチン結合能を持つ足場タンパク質であり，接着分子ネクチン，およびカドヘリンと複合体を形成するα-カテニンとの直接結合を介してカドヘリン・カテニン複合体を細胞間接着部位に誘導し，接着結合の形成を制御している（図1A）^1）．アファディンの全身性欠損マウスは上皮組織の発生が障害され，発生初期から中期に致死となる．このように多くの器官でアファディン遺伝子産物がその形態形成に重要な役割を果たしている．アファディンの長鎖スプライスバリアントであるl-アファディンは，カルボキシ末端のアクチン線維結合ドメインを有することを特徴とし（図1B），全身の幅広い組織に発現している．一方，短鎖のs-アファディンはアクチン線維結合ドメインを有さないスプライスバリアントであり，ほぼ脳のみに限局して発現している．s-アファディンは短鎖スプライスバリアントゆえ特異的抗体の作製が困難であり，その正確な局在は不明である．しかし，l-アファディンとs-アファディンの両者を認識する抗体とl-アファディンのみを認識する抗体での染色パターンの比較により，シナプスが数多く存在する脳領域におけるs-アファディンの発現が確認されている．

図1 接着結合とパンクタアドヘレンシア結合の分子構成とアファディンのドメイン構造

（A）非神経細胞の接着結合の分子構成．（B）アファディンのドメイン構造．（C）PAJの分子構成．図は，一般的な単純な形態の棘突起における興奮性シナプスの例であり，PAJはシナプス結合の近傍（ペリアクティブゾーン）に形成される．RA：Ras相互作用ドメイン，FHA：フォークヘッド関連ドメイン，DIL：ダイリュートドメイン，PDZ：PSD-95/Dlg/ZO-1ドメイン，PR：プロリンリッチ領域，CC：コイルドコイル領域，PAJ：パンクタアドヘレンシア結合，N-Cad：N-カドヘリン，N-1：ネクチン-1, N-3：ネクチン-3, l/s-Afa：l-アファディンおよびs-アファディン，αN-Cat：αN-カテニン．

成体の脳では，一つの神経細胞は数千の神経細胞とシナプスによって連結され，そこで行われるシナプス伝達によって神経回路の情報が伝達される．シナプス伝達の強度は，神経細胞への入力に依存して増減し，かつ，その変化は長期間保持される．この現象はシナプス可塑性と呼ばれ，学習や記憶に代表される高次脳機能の細胞基盤であると考えられている．シナプスは，構造が非対称な極性を持った特殊な細胞間接着であり，機能的な接着装置のシナプス結合が発達している（図1C）．シナプス結合は神経細胞の軸索上のシナプス前終末と，別の神経細胞の樹状突起上のシナプス後肥厚部が，シナプスオーガナイザーと呼ばれる一連の異種親和性の接着分子によって連結され，相互に機能分子を集積させて形成される．一方，興奮性シナプスのシナプス結合近傍の接着結合様の構造のPAJには，N-カドヘリンやαN-カテニン，β-カテニンといった接着結合分子，およびそれらの脳ホモログが集積している（図1C）^2）．近年のゲノム研究の結果，多くのPAJ分子が精神・神経疾患の原因ないし関連分子として見いだされており，ヒトを含む哺乳類で，PAJが神経細胞の機能に重要な役割を果たしていることが推察されている．事実，代表的なPAJ分子であるN-カドヘリン，αN-カテニンやβ-カテニンの機能を阻害するとシナプスが不安定化して未成熟なままとなり^3），シナプスの形態とシナプス伝達強度の活動依存的な変化が，数時間から数日といった長期の時間幅で維持できなくなる^4）．ネクチンの異常も記憶の固定化に影響を及ぼす^5）．このようにPAJ分子のシナプス機能において果たす役割が明らかにされつつある．しかし，神経科学の主たる研究対象であるシナプス結合とは異なり，PAJそのものの形成や機能，特にPAJとシナプス結合の構造と機能の関連性については不明な点が多い．

アファディンは，上皮細胞では接着結合の形成過程初期を制御しているが，上皮細胞の接着結合以外の接着構造の形成においても重要な役割を果たしている^1）．そこで筆者らは，PAJに局在するアファディンがシナプスの形成や機能に関与している可能性を考え，種々の脳特異的な条件つき欠損マウスを作成してPAJとシナプス結合におけるアファディン欠損の影響を解析した．その結果，アファディンを欠損した培養神経細胞では，PAJ分子および興奮性シナプスにおけるシナプス分子の集積異常が観察された^6）．機能的には興奮性シナプス伝達の強度およびシナプス小胞の放出確率の低下や，シナプス電位の主要素に貢献するAMPA型グルタミン酸受容体のシナプス後部の細胞表面における集積，およびシナプス小胞のリサイクリング効率の低下が認められた（図2A）^{6, 7）}．生体においても，アファディン欠損マウスにおいて，PAJが顕著に発達している海馬巨大苔状線維シナプスの数が減少していた^8）．電子顕微鏡による解析では，PAJが痕跡程度まで菲薄化し，シナプス後部構造で，シナプス後肥厚部のある棘突起の形態が単純化すると同時に，神経伝達物質受容体の集積部位であるシナプス後肥厚部とシナプス前部の神経伝達物質放出部位であるアクティブゾーンの面積，シナプス前部に連結しているシナプス小胞の数が減少していた（図2B）^9）．これらの結果から，PAJに局在するアファディンは，PAJそのものの形成，および，シナプス結合の前部・後部の両方の形成，シナプス伝達に関与していることが明らかとなった．

図2 アファディン欠損シナプスの表現型

（A）培養神経細胞におけるシナプス．（B）海馬巨大苔状線維シナプス．海馬巨大苔状線維シナプスのPAJは一般的な棘突起シナプスと異なり，棘突起の起始部付近の樹状突起に形成され，シナプス結合と距離的に離れた位置に存在する．PAJ：パンクタアドヘレンシア結合．

筆者らは，上述したアファディンのシナプスにおける機能の分子機構の解明を試みた．アファディン欠損マウス由来の海馬初代培養神経細胞に各種アファディン変異体を導入したところ，l-アファディンはアクチン線維結合ドメインとコイルドコイル領域（CC領域）を介してαN-カテニンとN-カドヘリンの集積を制御していたが，s-アファディンはその活性を示さなかった（図3A）．このうちCC領域は，αN-カテニン，αE-カテニンとの結合に必要十分な領域であった．したがって，PAJの形成にはl-アファディンが，少なくともアクチン線維とαN-カテニンとの結合を介して関与していることが明らかになった^10）．次に，マウスの脳ホモジネートから核とミトコンドリア画分を除いた上清をさらに遠心して得た軽量膜画分を界面活性剤で処理し，その可溶性画分からl-アファディンとs-アファディンの両方を認識する抗体とl-アファディンのみを認識する抗体を用いて取得した免疫沈降物を質量分析に供し，l-アファディンかs-アファディンのどちらかにより強い結合性を示す分子の同定を試みた．その結果，l-アファディンに比べ，s-アファディンと強い結合性を示す分子として，マギン／Cnksr2を見いだした^11）．マギンはAMPA型グルタミン酸受容体の足場であるシナプス後肥厚部に局在するPSD-95/Dlg4とS-SCAM/Magi2に結合する分子として見いだされた分子で^12），ヒトにおいてマギン遺伝子変異は，睡眠時てんかんと言語の遅れを伴う非症候性知的障害の原因となる^13）．また，マギンは低分子量Gタンパク質やMAPキナーゼのシグナル伝達を制御している^13）．そこでアファディンとマギンの結合をin vitro再構成系で検討したところ，アファディンのアミノ末端に位置するRas相互作用ドメインと，マギンのプレクストリン相同ドメインを含むC末端側が結合することを見いだした．さらに，Ras相互作用ドメインを欠くs-アファディンはシナプス後部におけるPSD-95の集積を誘導することができなかったが，全長のl-アファディンとs-アファディンは両者ともPSD-95の集積を誘導した．これらの結果から，アファディンのシナプスにおける機能を媒介する分子の一つとして，マギンが考えられた^11）．さらにマギン欠損マウス由来の海馬初代培養神経細胞において，シナプスにおけるPSD-95の集積程度，電気生理学的なシナプス伝達の強度，AMPA型グルタミン酸受容体のシナプスの細胞表面における集積程度に低下が認められた．これらの表現型は，アファディン欠損マウス由来の海馬初代培養神経細胞の表現型とほぼ一致しており^{6, 7）}，アファディンはマギンと協働してシナプス後部機能を制御していることが示唆された^11）．一方，マギン欠損はシナプス伝達の頻度に影響を及ぼさなかったことから，アファディン依存的なシナプス前部機能におけるマギンの貢献は乏しいと推察される．アファディン欠損マウス由来の神経細胞では，シナプスオーガナイザー分子の一つであるシナプス後部NGL-3/Lrrc4bとシナプス前部LAR/Ptprfの分子複合体に依存的なシナプス前部形成に異常が生じる（図3B）^14）．よってアファディン依存的なシナプス前部機能の制御にはLARを含む分子群が関与している可能性がある．

図3 シナプスにおけるアファディンの機能と結合分子

（A）PAJとシナプス後部．l-アファディンは，少なくともアクチン線維とαN-カテニンとの結合を介してPAJの形成に関与する．l-アファディンとs-アファディンは，マギンとの結合を介してシナプス後部機能を制御する．（B）シナプス前部．アファディンはLARを含む分子群を介してシナプス前部機能を制御する．N-1：ネクチン-1, N-3：ネクチン-3, PAJ：パンクタアドヘレンシア結合，CC：コイルドコイル領域，l/s-Afa：l-アファディンおよびs-アファディン．

ヒトにおいて，マギン遺伝子変異は睡眠時てんかんの原因となる．他のグループによって独自に樹立されたマギン欠損マウス系統では，大脳新皮質神経細胞の興奮性が上昇し，自発てんかん脳波が観察され，一部のマウスは全身性けいれん発作である強直間代発作を起こす^15）．しかし，筆者らが樹立したマギン欠損マウス系統では，このようなてんかん発作はまったく観察されていない^11）．そこで，揮発性GABA_A受容体アンタゴニストであるフルロチルを用いたてんかん誘発を行ったが，ここでもてんかん誘発性の増大は確認されず，統計学的に有意ではないものの，むしろ若干のてんかん誘発に対する抵抗性を認めた^11）．これら二つのマギン欠損マウス系統の表現型が異なる原因は不明であるが，可能性として遺伝的背景の違いが考えられる．これらマウス系統の相違の解明により，これまで知られていないてんかんの病態機序の解明につながる可能性がある．

アファディンを含め，種々のPAJ分子の欠損によりシナプス結合の機能に異常が生じるが，シナプス結合と独立の接着構造のPAJが形成されることの生物学的意義はいまだ不明である．筆者らは，PAJの機能の本質の解明を今後の目標としており，複数の仮説を考案し，検証を開始している．PAJだからこそ可能なシナプス制御の機構が解明されると，神経科学分野における新たな学問領域の創生に加え，未解明な精神・神経疾患の発症や病態進展の機構の解明につながる可能性も考えられる．今後の研究の進展に期待したい．