睡眠は幅広い生物種に保存された生存に必須な行動であり，我々の心身の健康にとっても不可欠であるが，その制御機構の多くはいまだ謎に包まれている．たとえば，睡眠の量には個人差があり，4～5時間の短時間睡眠でも健康に過ごせるショートスリーパーと呼ばれる人がいる一方で，10時間以上眠らなければ健康に過ごせない人もいる．このように，人により必要な睡眠の量が異なることが知られているが，これがどのような機構によって規定されているのかはわかっていない．
睡眠の量に加えて，睡眠の質も睡眠の制御機構を考える上で重要な要素である．一般に，睡眠の質は睡眠の深さと言い換えることができる．ヒトを含む哺乳類や鳥類の睡眠はノンレム睡眠とレム睡眠の2種類に分類することができるが，睡眠時間の大部分を占めるのはノンレム睡眠である．ヒトの場合，このノンレム睡眠はその深さに従って3段階に分類される．一方，基礎研究でよく使用されるマウスの場合，ヒトのように，ノンレム睡眠を深さで分けることはないが，睡眠遮断を行った後に睡眠不足を取り戻すために深い睡眠に入ることが知られている．しかし，この睡眠の質がどのように制御されているかも現状ほとんど明らかになっていない．
2. セリントレオニンキナーゼSIK3は睡眠の質と量を制御する
我々は睡眠の質と量の制御機構を明らかにするために，新規の睡眠制御分子の探索を試みた．この研究では，無作為に点変異を導入したマウスの順遺伝学的スクリーニングを行い，睡眠量に異常を来すマウスを探索した1）- 1) Miyoshi, C., Kim, S.J., Ezaki, T., Ikkyu, A., Hotta-Hirashima, N., Kanno, S., Kakizaki, M., Yamada, M., Wakana, S., Yanagisawa, M., et al. (2019) Methodology and theoretical basis of forward genetic screening for sleep/wakefulness in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116, 16062–16067.
．マウスの睡眠は脳波と筋電によって判定するのが一般的であるため，このスクリーニングでもこの判定法を採用した．その結果，リン酸化酵素SIK3が睡眠の質と量の制御に重要な役割を果たしていることが明らかになった．Sik3遺伝子上のスプライス変異Sleepyは，Sik3の13番エクソンの欠損を引き起こし（図1a），ノンレム睡眠量の増加を引き起こした2）- 2) Funato, H., Miyoshi, C., Fujiyama, T., Kanda, T., Sato, M., Wang, Z., Ma, J., Nakane, S., Tomita, J., Ikkyu, A., et al. (2016) Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature, 539, 378–383.
（図1b）．さらにこの変異は，ノンレム睡眠時デルタ波密度の増加ももたらした2）- 2) Funato, H., Miyoshi, C., Fujiyama, T., Kanda, T., Sato, M., Wang, Z., Ma, J., Nakane, S., Tomita, J., Ikkyu, A., et al. (2016) Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature, 539, 378–383.
（図1c）．ノンレム睡眠中の脳波は，デルタ波と呼ばれる1 Hzから4 Hzの成分が優位になる．マウスに睡眠遮断を行うと，その後のノンレム睡眠中のデルタ波が高まることから，ノンレム睡眠時のデルタ波密度は睡眠の深さや質の指標であると考えられている．このSleepy変異型Sik3で失われる13番エクソンには，プロテインキナーゼA（PKA）のリン酸化標的部位のセリン残基（S551）をコードする配列が含まれている（図1）．このS551をアラニンに置換し（S551A変異），S551のリン酸化を阻害した変異型マウスを作製したところ，Sleepy変異型マウスと同様の表現型が認められたことから，Sleepy変異型マウスの表現型はこのS551のリン酸化が阻害されたことに起因していると考えられる3）- 3) Honda, T., Fujiyama, T., Miyoshi, C., Ikkyu, A., Hotta-Hirashima, N., Kanno, S., Mizuno, S., Sugiyama, F., Takahashi, S., Funato, H., et al. (2018) A single phosphorylation site of SIK3 regulates daily sleep amounts and sleep need in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 115, 10458–10463.
．さらに，この表現型は神経細胞特異的にSleepy変異を導入しても再現された4）- 4) Iwasaki, K., Fujiyama, T., Nakata, S., Park, M., Miyoshi, C., Hotta-Hirashima, N., Ikkyu, A., Kakizaki, M., Sugiyama, F., Mizuno, S., et al. (2021) Induction of mutant Sik3Sleepy allele in neurons in late infancy increases sleep need. J. Neurosci., 41, 2733–274.
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過去の研究よりS551A変異は恒常的活性型変異であることが示されていることから5），我々はSIK3のノックアウト変異型マウスでも睡眠測定を行った．グルタミン作動性ニューロン（興奮性ニューロン）特異的にSIK3をノックアウトしたところ，ノンレム睡眠量とノンレム睡眠時デルタ波密度の減少が認められたが（図1d, e），この結果はSleepy変異型マウスとは逆の表現型であった6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
．一方，SIK3のキナーゼ活性はキナーゼドメイン上の221番目のトレオニン残基（T221）のリン酸化によって正に制御されていることが知られている（図1a）．そこで，このT221残基をアラニンに置換したところ（T221A），Sik3ノックアウトマウスと同様にノンレム睡眠時デルタ波密度が減少することがわかった6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
．さらに，Sik3Sleepy; T221A二重変異型マウスはSleepy変異型マウスと比較して顕著にノンレム睡眠量とノンレム睡眠時デルタ波密度が減少していた6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
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これらの結果から，SIK3は睡眠の質と量を制御しており，さらにこの制御は神経細胞におけるSIK3のキナーゼ活性によるものであることがわかった．この結果はSIK3が睡眠の質と量を制御する神経細胞内シグナル伝達経路を構成していることを示唆している．
3. LKB1は睡眠の質と量の制御機構におけるSIK3の上流因子である
上記の研究の流れから，我々は睡眠の質と量を制御するシグナル伝達経路におけるSIK3の上下流の因子を探索した．ここで，前述のT221はセリントレオニンキナーゼLKB1（liver kinase B1）によってリン酸化されることが以前から知られていた7）- 7) Lizcano, J.M., Göransson, O., Toth, R., Deak, M., Morrice, N.A., Boudeau, J., Hawley, S.A., Udd, L., Mäkelä, T.P., Hardie, D.G., et al. (2004) LKB1 is a master kinase that activates 13 kinases of the AMPK subfamily, including MARK/PAR-1. EMBO J., 23, 833–843.
．そこでLkb1ノックアウトマウスを作製し，睡眠測定を行ったところ，Sik3ノックアウトマウスやSik3T221A変異型マウスと同様にノンレム睡眠量とノンレム睡眠時デルタ波密度が減少することがわかった6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
．さらに，ノンレム睡眠時デルタ波密度の減少は，SIK3のT221残基に疑似リン酸化変異（グルタミン酸変異）を導入することで部分的に回復することも明らかになった6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
．以上の結果から，睡眠の質と量を制御するシグナル伝達経路において，LKB1はSIK3の上流因子として機能していることが明らかになった．
4. HDAC4は睡眠の質と量の制御機構におけるSIK3の下流因子である
順遺伝学的スクリーニングによってSleepy変異家系を確立した際，我々はSleepy2という別の変異家系も確立することに成功した．この変異家系の原因遺伝子を探索したところ，クラスIIヒストン脱アセチル化酵素Hdac4遺伝子上の変異であることが明らかになった．Sleepy2変異は，HDAC4の発現量を著しく低下させ，ノンレム睡眠量とノンレム時デルタ波密度を増加させた6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
．興味深いことに，SIK3が属するSIKファミリーのSIK1, SIK2はHDAC4の245番目のセリン残基をリン酸化することが知られていたため，HDAC4はSIK3にとっても基質である可能性が高いと考えられた8, 9）- 8) Berdeaux, R., Goebel, N., Banaszynski, L., Takemori, H., Wandless, T., Shelton, G.D., & Montminy, M. (2007) SIK1 is a class II HDAC kinase that promotes survival of skeletal myocytes. Nat. Med., 13, 597–603.
- 9) Henriksson, E., Säll, J., Gormand, A., Wasserstrom, S., Morrice, N.A., Fritzen, A.M., Foretz, M., Campbell, D.G., Sakamoto, K., Ekelund, M., et al. (2015) SIK2 regulates CRTCs, HDAC4 and glucose uptake in adipocytes. J. Cell Sci., 128, 472–486.
．そこで，キナーゼアッセイによる解析を試みたところ，SIK3もSIK1やSIK2と同様にこの残基をリン酸化したことから，HDAC4はSIK3の基質であることがわかった6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
．これらのことから，HDAC4はSIK3の下流で睡眠の質と量を制御していると予想された．これを検証するため，HDAC4のS245残基をアラニンに置換してリン酸化を阻害したところ，ノンレム睡眠量とノンレム睡眠時デルタ波密度が減少した6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
．さらに，Sleepy変異型マウス脳にS245A変異を導入したHDAC4タンパク質を強制発現させたところ，Sleepy変異型マウスの過眠の表現型が抑制された6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
．これらのことから，HDAC4はSIK3の下流因子として機能していることが明らかになった．
HDAC4において，S245残基は足場タンパク質14-3-3タンパク質の結合部位であり，この残基がリン酸化され14-3-3タンパク質が結合することによって，HDAC4の核への移行が阻害されることが知られている10, 11）．そこで，Sleepy変異型マウス脳におけるHDAC4について解析したところ，この変異型マウス脳ではこのS245残基のリン酸化が促進され（図2b），核内のHDAC4量が減少していた6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
．さらに，野生型マウス脳を用いた解析により，核内のHDAC4量は睡眠が深い明期中（睡眠期）は少なく，睡眠が浅くなる明期の終了直後では多いことも合わせて見いだした6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
（図2c）．これらの結果は，核内のHDAC4量は睡眠の質と逆相間の関係にあり，SIK3によるリン酸化がこの細胞内局在変化を制御していることを示している．また，HDAC4は転写制御因子であることから，SIK3はリン酸化を介してHDAC4の活性を抑制していると考えられる．なお，HDAC4はヒストン脱アセチル化酵素と呼称されるものの，その脱アセチル化活性は失われており，MEF2（myocyte enhance factor-2）などの転写因子のリプレッサーとして働くことで，転写を抑制している12）．
以上より，SIK3はLKB1, HDAC4とともに，LKB1-SIK3-HDAC4シグナル伝達経路を構成し，この細胞内シグナル伝達経路が睡眠の質と量の制御を担っていることが明らかになった（図2a）．
5. SIK3は睡眠の質と量を異なる脳領域で制御している
我々は次にこの経路が機能する脳領域と神経細胞種を探索した．Sleepy変異はSik3の13番エクソンの欠失を引き起こすことから，このエクソンを挟む位置にloxP配列を挿入したSik3floxマウスを作製し，このマウスとさまざまなCreマウスを交配させたマウスで睡眠測定を行った．まず，グルタミン酸作動性ニューロン（興奮性ニューロン）で発現するVglut2CreマウスとSik3floxマウスとを交配したところ，ノンレム睡眠量とノンレム睡眠時デルタ波密度が増加した．このことから，SIK3は興奮性ニューロンで睡眠の質と量を制御していることが明らかになった6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
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さらに他のCreマウスと交配させたマウスの睡眠測定を行ったところ，興味深いことに主に大脳皮質で発現するVglut1CreマウスやCamk2aCreマウスとSik3floxマウスを交配させた場合に，ノンレム睡眠時デルタ波密度のみが増加し（図3a～c），一方で視床下部で発現するFoxd1CreマウスとSik3floxマウスを交配させるとノンレム睡眠量のみが増加することがわかった6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
（図3d～e）．これらの結果は，SIK3が大脳皮質のニューロンにおいて睡眠の質を，視床下部のニューロンにおいて睡眠の量を制御している，すなわち，SIK3は睡眠の質と量を異なる脳領域で制御していることを示している．
6. SIK3の下流ではシナプス制御因子が機能している可能性が高い
ここまでの研究で，SIK3が睡眠覚醒を制御する細胞内シグナル伝達経路を形成しており，この経路においてSIK3の直下のシグナル因子としてHDAC4が機能していることを示したが，さらに下流の因子についても探索が進められている．前述の解析により，大脳皮質におけるSIK3シグナルが睡眠要求の制御に関与していることが示されたことから，大脳皮質においてSIK3の下流で睡眠要求を制御する分子をシングル核RNAシーケンシング（snRNA-seq）によって探索した．大脳皮質特異的に野生型SIK3を発現させたマウスとSleepy変異型SIK3を発現させたマウスを比較したところ，Sleepy変異によって，分泌タンパク質Nptx2，脳由来神経栄養因子Bdnf，下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドAdcyap1，転写因子Npas4などの遺伝子の発現量が上昇していた6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
．また，Sleepy変異型マウスと同様に睡眠要求が上昇している睡眠遮断マウスについても同様の解析を行ったところ，こちらでもBdnf遺伝子の発現上昇が確認された6）- 6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
．BDNFは睡眠恒常性の制御に関与していることが報告されている．さらに，この解析で発現量に変化がみられた遺伝子について遺伝子オントロジー（gene ontology：GO）解析を行ったところ，シナプス関連のGOが多くヒットするという結果が得られた．
我々の研究から，LKB1-SIK3-HDAC4経路が睡眠の質と量を制御していることが明らかになった．この系では，LKB1がリン酸化を介してSIK3を活性化し，SIK3がHDAC4をリン酸化することで細胞質に保持している．さらに，核内のHDAC4が減少することで，下流の遺伝子発現が促進されると考えられ，標的遺伝子は睡眠の質や量の制御に関与していると考えられる．また，北京生命科学研究所のLiu博士らのグループも，アデノ随伴ウイルスを用いたアプローチによって本研究と同様の結果を報告しており，この研究は成体における後天的な遺伝子操作がこのパスウェイによる睡眠覚醒の変化に十分であることが示している13）- 13) Zhou, R., Wang, G., Li, Q., Meng, F., Liu, C., Gan, R., Ju, D., Liao, M., Xu, J., Sang, D., et al. (2022) A signalling pathway for transcriptional regulation of sleep amount in mice. Nature, 612, 519–527.
．今後は，本研究で見いだされたシグナル伝達経路のさらなる全容解明や，この細胞内のイベントがどのような神経回路を介して睡眠の質と量を制御しているのかといった研究が必要であると考えられる．
引用文献References
1) Miyoshi, C., Kim, S.J., Ezaki, T., Ikkyu, A., Hotta-Hirashima, N., Kanno, S., Kakizaki, M., Yamada, M., Wakana, S., Yanagisawa, M., et al. (2019) Methodology and theoretical basis of forward genetic screening for sleep/wakefulness in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116, 16062–16067.
2) Funato, H., Miyoshi, C., Fujiyama, T., Kanda, T., Sato, M., Wang, Z., Ma, J., Nakane, S., Tomita, J., Ikkyu, A., et al. (2016) Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature, 539, 378–383.
3) Honda, T., Fujiyama, T., Miyoshi, C., Ikkyu, A., Hotta-Hirashima, N., Kanno, S., Mizuno, S., Sugiyama, F., Takahashi, S., Funato, H., et al. (2018) A single phosphorylation site of SIK3 regulates daily sleep amounts and sleep need in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 115, 10458–10463.
4) Iwasaki, K., Fujiyama, T., Nakata, S., Park, M., Miyoshi, C., Hotta-Hirashima, N., Ikkyu, A., Kakizaki, M., Sugiyama, F., Mizuno, S., et al. (2021) Induction of mutant Sik3Sleepy allele in neurons in late infancy increases sleep need. J. Neurosci., 41, 2733–274.
5) Sonntag, T., Vaughan, J.M., & Montminy, M. (2018) 14-3-3 proteins mediate inhibitory effects of cAMP on salt-inducible kinases (SIKs). FEBS J., 285, 467–480.
6) Kim, S.J., Hotta-Hirashima, N., Asano, F., Kitazono, T., Iwasaki, K., Nakata, S., Komiya, H., Asama, N., Matsuoka, T., Fujiyama, T., et al. (2022) Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth. Nature, 612, 512–518.
7) Lizcano, J.M., Göransson, O., Toth, R., Deak, M., Morrice, N.A., Boudeau, J., Hawley, S.A., Udd, L., Mäkelä, T.P., Hardie, D.G., et al. (2004) LKB1 is a master kinase that activates 13 kinases of the AMPK subfamily, including MARK/PAR-1. EMBO J., 23, 833–843.
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10) Yang, X.-J. & Seto, E. (2008) The Rpd3/Hda1 family of lysine deacetylases: from bacteria and yeast to mice and men. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 9, 206–218.
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12) Fitzmonz, H.-L. (2015) The Class IIa histone deacetylase HDAC4 and neuronal function: Nuclear nuisance and cytoplasmic stalwart? Neurobiol. Learn. Mem., 123, 149–158.
13) Zhou, R., Wang, G., Li, Q., Meng, F., Liu, C., Gan, R., Ju, D., Liao, M., Xu, J., Sang, D., et al. (2022) A signalling pathway for transcriptional regulation of sleep amount in mice. Nature, 612, 519–527.
著者紹介Author Profile
北園 智弘（きたぞの ともひろ）筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構 助教．博士（理学）．
略歴2012年九州大学理学部生物学科卒業．17年同大学院システム生命科学府システム生命科学専攻修了，博士（理学）．日本学術振興会特別研究員（DC1, PD）．筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構研究員を経て，24年より現職．
研究テーマと抱負睡眠要求の分子実体とこれを制御する分子機構の解明．なぜ生き物は眠くなるのかを明らかにすることで，私たちの脳の理解を大きく広げたい．
ウェブサイトhttps://wpi-iiis.tsukuba.ac.jp/japanese/（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）https://sleepymouse.jp/（研究室）
趣味映画鑑賞．
