© 2024 公益社団法人日本生化学会
心臓は最も早期より機能し始める臓器であり，秩序ある拍動は機械刺激を引き起こす．心臓管腔は，遺伝学的因子による制御機構とともに，物理情報などの遺伝子にコードされない環境因子にも依存して形成される．本稿ではその役割が明確であるものの，作用機構の多くがわかっていない機械刺激による制御機構について，特に心臓管腔を構成する心内膜内皮細胞で起きる力学応答シグナルについて紹介する．
これまで，さまざまなヒトの心疾患に関連する遺伝子の解明など，心臓発生の遺伝学は大きく進歩してきた1）．また心臓は常に拍動する臓器であることから推察できるように，発達過程における機械的な力が機能的な心臓形態の形成に不可欠な役割を持つことも明らかとなっている．生体シグナルと機械刺激は相互に調節される関係にある．たとえば，最も早期の心拍は，成体でみられるような電気刺激による調節ではなく，機械刺激によって開始される2）．これは，電気信号伝達に不可欠なギャップ結合が機能阻害されている場合でも収縮でき，心筋収縮が組織の変形から生じる機械刺激を通じて伝播することを示唆している．そして心臓発達が進行する中で，遺伝子により生体シグナル応答が調節され，電気的刺激による収縮制御へと置き換わる．
我々はゼブラフィッシュを用いた個体心臓の研究から，心臓の形づくりを制御する生体力学および機械感受性プロセスを研究してきた．ゼブラフィッシュは胚が透明であり，母体外で発生過程が観察可能であるため，機械的な摂動を研究する有利な個体モデルである．ゼブラフィッシュの心臓はヒトとは異なり1心房1心室で構成される．血液が流れる心臓管腔面は1層の心内膜内皮細胞で覆われ，細胞外マトリックスを隔てて心筋細胞層，さらに外層は心外膜が位置する（図1A）．また，心房と心室の境界部と，心室から全身へとつながる境界部では，それぞれ血液の逆流を防ぐための房室弁と動脈弁が形成される（図1A）3）．なお，ヒト心臓では三つの弁葉から成る三尖弁（右心房−右心室間）と，二つの弁葉から成る僧帽弁（左心房−左心室間）が存在するが，ゼブラフィッシュの心臓弁はどちらも二つの弁葉からなる．心内膜内皮細胞と弁間質細胞で構成される心臓弁は，一方向性の正確な血液循環を作り出すために必須であり，組織形態の動的なリモデリング過程を経て，機能的な弁構造が形づくられる．房室弁の形成過程を例にとると，①受精から約28～48時間が経過した胚（28～48時間胚）では，円筒状の早期心臓形態から円筒中間部に位置する細胞の体積が減少して砂時計形のくびれた形態へと変化する過程で，心房部，心室部それぞれを構成する心内膜内皮細胞がくびれ部（房室弁領域）へと移動する（図1B左端）4）．その後，②54時間胚ごろには弁領域の心室側に位置する心内膜内皮細胞が間葉細胞形質を獲得し（EndoMT：心内膜内皮間葉転換），細胞外マトリックスに向けて侵入する（図1B左から2番目）．そして72時間胚までに，③侵入した細胞に続いて複数の心内膜内皮が移動することで，房室弁領域では折りたたみ構造を形成する（図1B左から3番目）．この際，細胞外マトリックス組織の内部へ侵入した細胞は弁間質細胞を構成し，弁形態の頑強性を高める．一方で，心管腔の表面部では陥入した細胞間の結合が解離することで，管腔側に向けて突出する組織形態が造られ，その後④伸長することで弁葉構造が形成されるとともに，弁間質の再構成が進行する（図1B右端）5）．弁領域は他の領域と比較して血液の流れが速く，それに伴った高値のせん断応力を感受する．そして組織形態形成に伴い，双方向性であった血流方向が一方向性へと変化するため，時間当たりのせん断応力方向「ゆらぎ」情報（oscillatory shear index）が変化する場でもある．また同時期（3日胚～）の心室心筋に着目すると，心室壁から心内腔側へ向かう多細胞突起の形態変化が起こり，多層化による組織剛性の増加と，心筋収縮力を高めるために働く肉柱の形成が開始する6）．つまり，心臓管腔を構成する心内膜内皮は血流の変化によって生じるせん断応力や血圧，心筋収縮の変化によって生じる伸展張力，また組織固有の剛性によって発生する応力など，複数の動的ストレスを感受しており，これらは心臓管腔の特徴的構造形成に影響を及ぼすと考えられる（図1A）．
（A）ゼブラフィッシュの早期心臓（5日胚）構造と，領域によって異なる組織構成と機械的刺激について．心内膜内皮細胞は管腔側から血行せん断応力や血圧誘導性膜張力，間質側から心筋伸展・収縮張力などを感受する．せん断応力は房室弁および流出路で顕著に高い．（B）早期房室弁形成過程．弁領域では細胞内体積量の低下とともに心房・心室両側より心内膜内皮細胞が移動する（36時間胚）．続いて心室側に近い房室弁領域細胞が間葉系細胞へと転換し（EndoMT），出芽した細胞が細胞外マトリックスへ侵入する（54時間胚）．内部へ侵入した細胞が弁間質細胞へと形質変化すると同時期（72時間胚），陥入した細胞間の接着が剥離し，折りたたみ構造から管腔側へ突出した弁構造ができる．細胞増殖に伴い弁葉構造が完成し，組織内部では弁間質の再編成が進行することで，血流に抵抗性をもつ心臓弁として機能し始める（126時間胚）．マゼンタ，青，緑はそれぞれ心房側，房室弁領域，心室側心内膜内皮細胞．黄色：弁間質細胞，矢印：細胞移動方向．参照：Chow, R.W., et al. （2022） PLoS Biol., 20, e3001505.
生体力学応答は，機械的な力が細胞内で化学信号に変換されるプロセスである．機械感受性タンパク質は細胞膜や核膜に局在することが知られ，細胞頂端部，細胞間接触部，基底部と細胞外マトリックスとの接着部位などが外部機械刺激を感知する場となる．細胞に外力が作用すると，機械的応力により細胞膜の変形が引き起こされる．この変形は機械感受性タンパク質を介して生化学シグナルに変換され，遺伝子発現，細胞分化，細胞形態の変化などのさまざまな細胞反応を調節できる細胞内シグナル伝達カスケードを開始する7）．また，細胞内のアクトミオシンネットワークも力とストレス発生の場に積極的に関与し，力学情報を伝達し，組織の変形に寄与する7）．
心内膜内皮細胞では，Notch, Wntなどのシグナル伝達経路が形態形成において不可欠の役割を果たす．これらの経路が機械刺激応答経路とどのように連関するかを探ることは，心臓形成を包括的に理解するために重要な課題である．たとえば，転写因子として働くKlf2a（Krüppel-like factor 2a）は，機械刺激に応答して房室弁形態形成を制御する（図2）8）．管腔に面した心内膜内皮細胞では，せん断応力に応答して誘導されたKlf2aがWnt9a/bの転写活性化を誘導し，弁構造内部に位置する間葉系細胞のTcf/β-cateninシグナル伝達を細胞非自律的に活性化することで，弁形態形成を制御する（図2）9）．さらにKlf2aは，同じく房室弁領域の管腔面で機械刺激に依存した発現調節を受けるNotch1bと協調的に働き，細胞自律的にVegfr3（Flt4）の発現を負に調節することで心内膜内皮の間質へ向けた移動を抑制するが，Klf2a活性の低い間質側の心内膜細胞ではVegfr3（Flt4）活性化を介して弁間質形成を調節する（図2）10）．
房室弁形成に関わる機械刺激依存性シグナル伝達の一例と，弁形成における役割について．複数の機械刺激受容体が機能し，遺伝学的調節との相互作用から多様なシグナル応答機構が調節される．青矢印は筆者らが見いだしたシグナル経路．CaN：カルシニュリン．
上記のように，複数の因子が機械刺激に応答して生体機能調節に関わることが明らかになってきた．しかしながら，機械刺激と生体シグナル調節の間をつなぐ過程はいまだに議論の余地がある．たとえば，機械刺激は細胞膜上に局在するTrpp2およびTrpv4といったTrp（transient receptor potential）チャネルを活性化し，Ca2＋流入によりKlf2a発現を亢進する（図2）11）．しかし，このCa2＋流入がどのようにklf2a転写に関連しているかは不明である．一方で，同じく細胞膜上に局在する機械刺激受容体であるPkd2（Trpp2），Pkd1a，そしてPkd1l1がともに変異すると，Ca2＋流入は低下するがklf2aの発現が亢進する（図2）12）．これらは機械受容体機能を介した正反対の報告であり，機械受容体の組合わせに依存して，血流などの機械刺激がklf2aの発現レベルをチューニングできるという可能性などが議論されている12）．つまり，機械刺激による直接的な生体シグナル調節過程を明確にすることが，力学生体応答の理解を深めることにつながる．そこで，我々はまずセカンドメッセンジャーとして機能するCa2＋に着目した．なぜならば，ヒト肺動脈内皮細胞（hPAECs）やヒト臍帯血静脈内皮細胞（HUVECs）を用いた培養条件では，ポンプを用いて培養液中に流れを発生させると，せん断応力に応答して細胞内にCa2＋が流入するからである13）．個体心臓管腔組織でCa2＋調節機構は不明であったことから，高速イメージングを可能とするライトシート顕微鏡と，蛍光Ca2＋センサーであるGCaMP7aを心内膜内皮細胞で発現する系統を樹立し，拍動する状態で心臓弁形成過程を観察した．その結果，弁領域にほぼ限定した高頻度のCa2＋流入が認められ，さらにCa2＋流入は機能的な弁形態が構築される時期と相関し，2日胚をピークとして6日胚には消失することを見いだした．次に，Ca2＋流入が拍動に依存した現象であるのか検討した．拍動を強く減弱させると，速やかにCa2＋流入が消失し，また拍動の再開によりCa2＋の再流入が起きた．以上の結果を受けて，弁形成時の心内膜内皮で起きるCa2＋流入は心臓の拍動が必要であることが明らかとなった．一方で，心拍動が停止するとさまざまな生理的パラメーター変化が起こるため，心内膜内皮で起きるCa2＋流入が拍動に関連した機械刺激により直接制御されるのか明確にできない．そこで我々は機械刺激自体が持つ作用を明確にすべく，心臓管腔内へ直径約50 µmの磁気ビーズを挿入する手技を確立した．拍動する心臓内では，挿入されたビーズが動き続けることで心内膜内皮細胞に対して異所性の圧力とせん断応力が発生し，ビーズに依存したCa2＋流入が認められた．さらなる検討として，拍動停止により管腔内に応力が存在しない状態下で胚体外から磁力が定量可能な磁気プローブを操作し，心管腔内磁気ビーズを引っぱることで機械刺激を人為的に入力した（個体磁気ピンセット法）．そして，アウトプットとなるCa2＋流入を測定することで，機械刺激自体が直接的に心内膜内皮細胞のCa2＋流入を引き起こすと説明することができた14）．
本実験系で評価したCa2＋応答は，機械刺激によりCa2＋流入を促進することが知られる代表的な受容体と力学感知オルガネラ（Trpチャネル，Piezoチャネル，一次繊毛）の関与が認められなかった．血管内皮細胞や骨芽細胞では，機械刺激により細胞外へ放出されたATPを認識するプリン受容体（P2Xs/P2Ys）を介して，Ca2＋が細胞内へ流入することが知られる13）．そこで細胞外ATPの関与を検討したところ，ATP調節に依存して心内膜内皮細胞のCa2＋流入が制御されることが明らかになった．プリン受容体ファミリーの一つであるP2rx4aが心内膜内皮で発現すること，またP2rx4aのドミナントネガティブ体を発現することで，Ca2＋流入が有意に抑制されることが明らかとなった．
では，細胞に流入したCa2＋はどのように作用するのか．転写因子であるNfatc1（nuclear factor activated-T cells 1）は細胞内Ca2＋流入に依存して核内へと移行し，心臓弁形成に関わる因子群の転写を活性化する15）．そこで，Nfatファミリーに対するDNA結合モチーフを並列に四つつなぎ，下流にミニマルプロモーターと蛍光遺伝子を配置した人工遺伝子を導入し，Nfat活性を可視化できる系統を樹立した．観察の結果，Ca2＋流入と同様に，弁領域の形成時期に限定してNfatが活性化すること，異所性の機械刺激によって活性が誘導されること，そしてP2rx4aのドミナントネガティブ体により抑制されることが明らかになった．以上より，機械刺激に応答した心臓を形成するための新たな機構「機械刺激→細胞外ATP放出→Ca2＋流入→Nfat活性化を介した弁形成機構」を報告した（図2）14）．なお，Nfat活性化を介した弁形成調節機構は種間で異なるようである．マウスでは心筋層から分泌されるVEGFを介してNFATが活性化することで，弁形成の一過程であるEndoMTが進行する15）．一方で，ゼブラフィッシュでは，Vegf活性を阻害してもNfat活性に影響せず，機械刺激によるCa2＋流入に依存してNfatが活性化し，転写因子Twist1bの発現を誘導することがEndoMTにとって重要であった．なお，ヒト先天性心疾患を示す遺伝子データベース中にNfatc1の変異報告はなく，Nfatc1が弁形成のために機能するメカニズムがヒトでも保存されているかどうかは不明のままである．
本研究では，ゼブラフィッシュ心臓へ継続的に異所性の力を入力することでCa2＋流入，Nfat活性化だけでなくklf2a/klf4発現も誘導された．ただし，P2rx4aのドミナントネガティブ体の発現，またはNfatシグナル活性の阻害に関わらず，klf2a/klf4の発現誘導は影響しなかった．この結果は，機械感受性シグナル伝達機構が分岐して存在することを示唆する．心臓管腔では細胞自身が感受する力の種類によって応答が変化することを意味しており，Nfat活性化は心内膜内皮細胞のプリン受容体活性化に応答した経路に由来する．そして一つの仮説として，膜伸展張力を感受することが知られるPiezoやTrpチャネルを介した機械受容体活性化がKlf2発現を調節し，せん断応力を感受した経路で活性化することが知られる細胞外ATPを介した機械受容体活性経路と協調的に作用することが，適切な弁形態形成を調節する可能性が考えられる．
著者らの研究では，機械刺激による生体電気シグナルが心臓の「造形」を制御する機序を新たに提示した．しかし，いまだに解決できない疑問は多く存在する．心臓では組織，領域，そしてタイミングで異なったストレスが作用する．また同一の細胞中でも複数の力学シグナル経路活性が誘導される．それに関連して，我々が見いだしたCa2＋流入，Nfat活性化が，なぜ時期と領域がともに限定的なのかは明らかでない．さらに，心臓の遺伝的要因との連関も組織形態形成の調整に寄与しており，複雑に絡み合う生命現象の理解は容易ではない．ただし解析技術は日々進歩しており，心臓の発生生物学と組織工学，生物物理学などさまざまな視点から挑むことでメカニズムの理解に向かうことができるであろう．
1) Tada, H., Fujino, N., Hayashi, K., Kawashiri, M.A., & Takamura, M. (2022) Human genetics and its impact on cardiovascular disease. J. Cardiol., 79, 233–239.
2) Chiou, K.K., Rocks, J.W., Chen, C.Y., Cho, S., Merkus, K.E., Rajaratnam, A., Robison, P., Tewari, M., Vogel, K., Majkut, S.F., et al. (2016) Mechanical signaling coordinates the embryonic heartbeat. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, 8939–8944.
3) O’Donnell, A. & Yutzey, K.E. (2020) Mechanisms of heart valve development and disease. Development, 147, dev.183020.
4) Vignes, H., Vagena-Pantoula, C., Prakash, M., Fukui, H., Norden, C., Mochizuki, N., Jug, F., & Vermot, J. (2022) Extracellular mechanical forces drive endocardial cell volume decrease during zebrafish cardiac valve morphogenesis. Dev. Cell, 57, 598–609.
5) Chow, R.W., Fukui, H., Chan, W.X., Tan, K.S.J., Roth, S., Duchemin, A.L., Messaddeq, N., Nakajima, H., Liu, F., Faggianelli-Conrozier, N., et al. (2022) Cardiac forces regulate zebrafish heart valve delamination by modulating Nfat signaling. PLoS Biol., 20, e3001505.
6) Rasouli, S.J. & Stainier, D.Y.R. (2017) Regulation of cardiomyocyte behavior in zebrafish trabeculation by Neuregulin2a signaling. Nat. Commun., 8, 15281.
7) Bailles, A., Gehrels, E.W., & Lecuit, T. (2022) Mechanochemical principles of spatial and temporal patterns in cells and tissues. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 38, 321–347.
8) Lee, J.S., Yu, Q., Shin, J.T., Sebzda, E., Bertozzi, C., Chen, M., Mericko, P., Stadtfeld, M., Zhou, D., Cheng, L., et al. (2006) Klf2 is an essential regulator of vascular hemodynamic forces in vivo. Dev. Cell, 11, 845–857.
9) Goddard, L.M., Duchemin, A.L., Ramalingan, H., Wu, B., Chen, M., Bamezai, S., Yang, J., Li, L., Morley, M.P., Wang, T., et al. (2017) Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Dev. Cell, 43, 274–289 e275.
10) Fontana, F., Haack, T., Reichenbach, M., Knaus, P., Puceat, M., & Abdelilah-Seyfried, S. (2020) Antagonistic activities of Vegfr3/Flt4 and Notch1b fine-tune mechanosensitive signaling during zebrafish cardiac valvulogenesis. Cell Rep., 32, 107883.
11) Heckel, E., Boselli, F., Roth, S., Krudewig, A., Belting, H.G., Charvin, G., & Vermot, J. (2015) Oscillatory flow modulates mechanosensitive klf2a expression through trpv4 and trpp2 during heart valve development. Curr. Biol., 25, 1354–1361.
12) Juan, T., Ribeiro da Silva, A., Cardoso, B., Lim, S., Charteau, V., & Stainier, D.Y.R. (2023) Multiple pkd and piezo gene family members are required for atrioventricular valve formation. Nat. Commun., 14, 214.
13) Yamamoto, K., Korenaga, R., Kamiya, A., & Ando, J. (2000) Fluid shear stress activates Ca(2+) influx into human endothelial cells via P2X4 purinoceptors. Circ. Res., 87, 385–391.
14) Fukui, H., Chow, R.W., Xie, J., Foo, Y.Y., Yap, C.H., Minc, N., Mochizuki, N., & Vermot, J. (2021) Bioelectric signaling and the control of cardiac cell identity in response to mechanical forces. Science, 374, 351–354.
15) Wu, B., Baldwin, H.S., & Zhou, B. (2013) Nfatc1 directs the endocardial progenitor cells to make heart valve primordium. Trends Cardiovasc. Med., 23, 294–300.
徳島大学先端酵素学研究所生体力学シグナル分野 独立准教授．博士（生命科学）．
2004年名古屋市立大学薬学部卒業．09年京都大学大学院生命科学研究科修了．同年京都府立医科大学助教．12年～23年国立循環器病研究センター研究所上級研究員のち室長．17年～20年フランス遺伝学細胞生物学研究所研究員．23年より現職．
研究テーマと抱負研究室のテーマ：個体の形づくりに不可欠な細胞内外で生じる「力」の作用を理解すること．抱負：ユニークなアプローチによる力作用の解明．
ウェブサイトhttps://www.iams.tokushima-u.ac.jp/lab/fukui/
This page was created on 2024-07-19T09:34:05.805+09:00
This page was last modified on 2024-08-19T09:55:07.000+09:00
このサイトは（株）国際文献社によって運用されています。
