生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

ヒト免疫不全症ウイルス1型（HIV-1）は，エイズの原因ウイルスの一つであり，全世界で3900万人の感染者が報告される（2022年時点）公衆衛生上の脅威である．HIV-1は被膜ウイルスであり，複製サイクル後期に宿主感染細胞の細胞膜から出芽する際に，宿主膜脂質を被膜として獲得する．この一連の過程に中心的な役割を果たすのがウイルス由来のマルチドメインタンパク質，Gag（Group-specific antigen）である．Gagは宿主細胞の細胞質で翻訳されたのち，N末端matrix（MA）ドメインのミリストイル化と塩基性アミノ酸に富んだ配列によって，細胞膜内層の酸性リン脂質PI（4,5）P₂にターゲットされる．膜上にリクルートされたGagは，Gag latticeと呼ばれる多量体を形成し，ウイルス粒子形成の足場となる．多量体の形成とともにlattice固有の膜曲率を持った新粒子の出芽が進行し，最終的に宿主タンパク質の働きで細胞外へ放出される^1）

• 1) Freed, E.O. (2015) HIV-1 assembly, release and maturation. Nat. Rev. Microbiol., 13, 484–496.

図1 HIV-1出芽におけるGagおよびGagと脂質ドメインの可視化

（A） Gagは細胞膜内層で多量体を形成し，新ウイルス粒子形成の足場となる．（B）細胞膜内層のGagは蛍光タンパク質を融合したGagを発現させて可視化した．細胞膜外層のSM, Cholは蛍光脂質プローブを培地に加えることにより標識，可視化した．右写真は共焦点顕微鏡による蛍光像．スケールバーは10 µm.

複数のリピドミクス解析により，ウイルス粒子にはスフィンゴミエリン（SM），コレステロール（Chol）やPI（4,5）P₂など，特定の脂質が，宿主細胞の細胞膜に比べて濃縮されていることが報告されている^2）

• 2) Mücksch, F., Citir, M., Lüchtenborg, C., Glass, B., Traynor-Kaplan, A., Schultz, C., Brügger, B., & Kräusslich, H.G. (2019) Quantification of phosphoinositides reveals strong enrichment of PIP₂ in HIV-1 compared to producer cell membranes. Sci. Rep., 9, 17661.

哺乳動物細胞の細胞膜は，構成脂質が内外層で非対称的に分布する特徴的な構造をとる．SMは細胞膜脂質の約10％を占め，その90％が外層に存在する主要な構成脂質である．Cholもまた，細胞膜脂質の約40％を構成する主要な脂質であるが，その層間分布は決定されていない．SMとCholはその高い親和性によって，細胞膜上で集合体（脂質マイクロドメイン）を形成すると考えられている^3）

• 3) Levental, I., Levental, K.R., & Heberle, F. (2020) Lipid rafts: Controversies resolved, mysteries remain. Trends Cell Biol., 30, 341–353.

細胞膜内層で多量体形成するGagが，SMのような外層の脂質を濃縮するメカニズムは不明である．近年，蛍光脂質類似体を用いた解析が行われたが，必ずしも濃縮を説明しない^{4, 5）}

• 4) Sengupta, P., Seo, A.Y., Pasolli, H.A., Song, Y.E., Johnson, M.C., & Lippincott-Schwartz, J.A. (2019) A lipid-based partitioning mechanism for selective incorporation of proteins into membranes of HIV particles. Nat. Cell Biol., 21, 452–461.
• 5) Favard, C., Chojnacki, J., Merida, P., Yandrapalli, N., Mak, J., Eggeling, C., & Muriaux, D. (2019) HIV-1 Gag specifically restricts PI(4,5)P2 and cholesterol mobility in living cells creating a nanodomain platform for virus assembly. Sci. Adv., 5, eaaw8651.

はじめに，細胞膜内層でGagが多量体を形成し，出芽に至る過程における内在性の脂質の分布・動態の可視化を行った．Gagタンパク質の単独発現により，感染・複製能を持たないウイルス様粒子（virus-like particles：VLPs）を産生できることが広く知られており，本研究でもこの実験系を用いた．そしてGagの可視化には，N末端のMAとcapsid（CA）ドメインの間に蛍光タンパク質（FP）を挿入した構築Gag-FPを用いた．また，多量体形成時のGag-FPによる立体障害を避けるために，タグなしGagとGag-FPの3 : 1混合物を発現させた．内在性のSMおよびCholの可視化には，NT-Lys（non-toxic lysenin）およびD4をプローブとして使用した．両者はそれぞれ，ミミズEisenia foetida，細菌Clostridium perfringens由来の孔形成毒素lysenin, perfringolysin Oの毒性のない脂質結合ドメインであり，それぞれ5分子以上のSMの集合体，40％以上のCholを含む膜に特異的に結合する^{7, 8）}

• 7) Tomishige, N., Murate, M., Didier, P., Richert, L., Mély, Y., & Kobayashi, T. (2021) The use of pore-forming toxins to image lipids and lipid domains. Methods Enzymol., 649, 503–542.
• 8) Kobayashi, T., Tomishige, N., Inaba, T., Makino, A., Murata, M., Yamaji-Hasegawa, A., & Murate, M. (2021) Impact of intrinsic and extrinsic factors on cellular sphingomyelin imaging with specific reporter proteins. Contact (Thousand Oaks), 4, 25152564211042456.

実験では，HeLa細胞にGagを一過性に導入し，24時間後に細胞膜外層の脂質を蛍光脂質プローブで標識したサンプルを観察・計測に供した（図1B

• 図1 HIV-1出芽におけるGagおよびGagと脂質ドメインの可視化

ウイルス粒子は直径100～150 nm，脂質マイクロドメインは直径5～50 nmとされる．このサイズは光学顕微鏡の回折限界以下であるため，観察・計測には超解像顕微鏡や異なるプローブ間の距離や比率に感度の高い，FLIM-FRET（fluorescence lifetime imaging based on Förster resonance energy transfer）を使用した．また，脂質ドメインの動態計測にはFRAP（fluorescence recovery after photobleaching）を使用した．

1）Gagと脂質ドメインの超解像観察

GagがSMとCholをウイルス粒子に濃縮することから，まず細胞膜を挟んだGagと脂質ドメインの共局在を超解像顕微鏡PALM/dSTORM（photoactivated localization microscopy/direct stochastic optical reconstruction microscopy）により観測した．具体的には，Gag/Gag-mEos4bを発現させた細胞の細胞膜外層を，SNAPタグを介してAlexa Fluor 647で標識したAF647-NT-Lys，またはAF647-D4で染色した．mEos4bは，UV域の光照射により蛍光が緑から赤へ変化する（photoconversion），PALMに適したタンパク質である．二量体を形成しうる親mEos2への変異導入により作製されたmEos4bは，ほぼ完全に単量体であり，蛍光特性も改良された．また，Gag多量体化の効果を評価するために，多量体化不全変異体Gag-WM^9）

• 9) von Schwedler, U.K., Stray, K.M., Garrus, J.E., & Sundquist, W.I. (2003) Functional surfaces of the human immunodeficiency virus type 1 capsid protein. J. Virol., 77, 5439–5450.

また，超解像顕微鏡によって局在化した脂質プローブのクラスター解析により，ドメインサイズを推定した．SMに富んだ脂質ドメインの直径は，野生型Gagの発現によってのみ有意に増加したが，Cholに富んだ脂質ドメインの直径はGagの発現によって変化しなかった．これらの結果は，Gagは多量体化の際にSMに富んだ脂質ドメインを集め，より大きなドメインを形成することを示唆している．

2）脂質ドメイン動態への影響

さらに，脂質ドメイン動態へのGagの影響を検証するために，EGFP-NT-LysまたはEGFP-D4のFRAPを行った．コントロールではEGFP-NT-Lysの蛍光は85％まで回復した（mobile画分）が，Gag存在下では蛍光回復は64％に抑えられた．すなわち，immobile画分が15％から36％に有意に増加した．この結果は，Gagの発現がSMに富んだ脂質ドメインの拡散を抑えることを示している．一方で，Cholに富んだ脂質ドメインは，Gagの発現にかかわらず常に動きが抑えられていた．

次に，2種類の異なる脂質ドメインの相対的な分布・動態に対するGagの影響を評価するために，アクセプターmCherry-D4存在下，ドナーEGFP-NT-LysのFLIM-FRETを行った．ドナーとアクセプターが存在する条件では，二つのドナー集団が予測される．一方は，アクセプターとFRETを生じる距離にない（非相互作用）集団であり，他方はFRETを生じる距離内に存在する（相互作用）集団である（図2A

• 図2 FLIM-FRETによるGag依存の脂質ドメイン再編の計測

図2 FLIM-FRETによるGag依存の脂質ドメイン再編の計測

（A） 2種類の脂質プローブで標識した細胞膜外層のモデル．τ₂はアクセプター非存在下のドナー蛍光寿命．（B）計測により得られた蛍光減衰曲線は，二重指数関数モデルによるフィッティングを行い，α₁とτ₁を得る．α₁とα₂は相互作用集団と非相互作用集団の割合を示す．（C）（τ_1, α₁）を示す相互作用集団と比較して，（左）さらにドナーとアクセプターが近接する場合，かつ／または，（右）ドナーの周りのアクセプター数が増加する場合，τ₁が減少する．また，相互作用集団が増加する場合，α₁が増加する．（D）Gagなし（DA），または，Gag野生型（WT），多量体形成不全（WM），膜曲率の大きい（∆L），膜曲率の小さい変異体（P99A, EE）を発現する細胞におけるEGFP-NT-LysとmCherry-D4間のFLIM-FRETの代表的な1回の結果（n＝10 cells）．橙色の点は各ピクセルにおける相互作用集団のEGFP-NT-Lysの蛍光寿命τ₁［ns］（縦軸）とそのamplitude α₁［％］（横軸）を示す．青い等高線は等間隔に確率分布を示す．青い破線はτ₁，τ₂をα₁，α₂で加重平均した蛍光寿命τの位置を示す．（D）は文献6より一部改変．

以上より，Gagは細胞膜外層のSMあるいはCholに富んだ脂質ドメインの裏側（内層）に存在するPI（4,5）P₂に到達したのち，多量体形成に伴って近傍のSMに富んだ脂質ドメインを捕捉してより大きな脂質ドメインを形成すると推測された（図3

• 図3 HIV-1 Gagによる脂質濃縮のモデル

図3 HIV-1 Gagによる脂質濃縮のモデル

GagはSMあるいはCholに富んだ脂質ドメイン直下のPI（4,5）P₂にターゲットされたのち，SMに富んだ脂質ドメインを捕捉することにより，SMとCholに富んだ脂質ドメインを形成する．この脂質濃縮は，Gag多量体形成時に生じる膜曲率と相関する．

最後に，多量体化に伴い形成される膜曲率の脂質ドメイン再編への効果を検証した．そのためにGag-∆L, Gag-P99A, Gag-EE変異体を使用してFLIM-FRET実験を行った．P99A, EEは平たい多量体を形成するため小さい膜曲率を示し，∆LはVLPが膜から切り離されないため野生型の膜曲率を持った粒子を膜上に蓄積する^{4, 10, 11）}

• 4) Sengupta, P., Seo, A.Y., Pasolli, H.A., Song, Y.E., Johnson, M.C., & Lippincott-Schwartz, J.A. (2019) A lipid-based partitioning mechanism for selective incorporation of proteins into membranes of HIV particles. Nat. Cell Biol., 21, 452–461.
• 10) Hogue, I.B., Grover, J.R., Soheilian, F., Nagashima, K., & Ono, A. (2011) Gag induces the coalescence of clustered lipid rafts and tetraspanin-enriched microdomains at HIV-1 assembly sites on the plasma membrane. J. Virol., 85, 9749–9766.
• 11) Grover, J.R., Llewellyn, G.N., Soeilian, F., Nagashima, K., Veatch, S., & Ono, A. (2013) Roles played by capsid-dependent induction of membrane curvature and Gag-ESCRT interactions in tetherin recruitment to HIV-1 assembly sites. J. Virol., 87, 4650–4664.

なぜウイルスはSMとCholを被膜に濃縮するのだろうか？　生理的温度における水–脂質単成分系では，シス型の不飽和アシル鎖を持つ脂質の二重膜は，アシル鎖の配向が乱れた，流動性の高い，“柔らかい”膜，液体無秩序相（液晶相）［liquid-disordered phase］を示す．一方，SMのようなスフィンゴ脂質など，飽和アシル鎖を持つ脂質の二重膜は，アシル鎖の配向がそろい，非常に緊密に充填された，流動性のないゲル相を示す．ゲル相へのChol添加によりアシル鎖の配向はそろいつつも流動性を保持した，密に充填され，透過性の制限された，“硬い”膜，液体秩序相［liquid-ordered（Lo）phase］が生じる．冒頭でふれたSMとCholからなる脂質マイクロドメインは，Lo phaseの性質を示すと考えられている^3）

• 3) Levental, I., Levental, K.R., & Heberle, F. (2020) Lipid rafts: Controversies resolved, mysteries remain. Trends Cell Biol., 30, 341–353.

最近，宿主由来の中性スフィンゴミエリナーゼ（nSMase2）が，ウイルス粒子の成熟に必要であることが報告された^{13, 14）}

• 13) Waheed, A.A., Zhu, Y., Agostino, E., Naing, L., Hikichi, Y., Soheilian, F., Yoo, S.-W., Song, Y., Zhang, P., Slusher, B.S., et al. (2023) Neutral sphingomyelinase 2 is required for HIV-1 maturation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 120, e2219475120.
• 14) Yoo, S.-W., Waheed, A.A., Deme, P., Tohumeken, S., Rais, R., Smith, M.D., DeMarino, C., Calabresi, P.A., Kashanchi, F., Freed, E.O., et al. (2023) Inhibition of neutral sphingomyelinase 2 impairs HIV-1 envelope formation and substantially delays or eliminates viral rebound. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 120, e2219543120.

細胞膜内層と外層の脂質ドメインは膜を挟んで共役していると考えられているが，そのメカニズムは不明である^3）

• 3) Levental, I., Levental, K.R., & Heberle, F. (2020) Lipid rafts: Controversies resolved, mysteries remain. Trends Cell Biol., 30, 341–353.