トランスポーターは，栄養素や代謝産物，さらには外来性の薬物などの多様な分子の膜を越えた輸送を担う膜輸送体の一員であり，他の膜輸送体，チャネルやポンプなどと同様に，物質の濃度勾配を作り出すことで生体恒常性の維持に重要な役割を果たしている．SLC（solute carrier）トランスポーターとABC（ATP binding cassette）トランスポーターに分けられ，SLCトランスポーターは，66のサブファミリーが存在し，約450種類の分子が含まれる．一方で，SLCトランスポーターは，その重要性にもかかわらず，必ずしも研究が進んでいない．限られた分子のみが盛んに研究され1）- 1) César-Razquin, A., Snijder, B., Frappier-Brinton, T., Isserlin, R., Gyimesi, G., Bai, X., Reithmeier, R.A., Hepworth, D., Hediger, M.A., Edwards, A.M., et al. (2015) A call for systematic research on solute carriers. Cell, 162, 478–487.
，生理機能が明らかになっていない分子が多く存在することが知られている2）- 2) Meixner, E., Goldmann, U., Sedlyarov, V., Scorzoni, S., Rebsamen, M., Girardi, E., & Superti-Furga, G. (2020) A substrate-based ontology for human solute carriers. Mol. Syst. Biol., 16, e9652.
．さらには，栄養素などの輸送システムは，恒常性を維持するために頑強に作られており，必ずしも単一のトランスポーターで構築されていない．そのため，トランスポーターなどの膜輸送体の生理機能や疾患における重要性，さらには輸送システムの全体像を明らかにするシステマチックな研究手法の開発が求められている．
トランスポーターを含む膜輸送体は生理機能の維持に重要であるため，その機能の欠失は疾患を引き起こす場合がある．たとえば，ヘテロ二量体アミノ酸トランスポーター（heterodimeric amino acid transporters：HATs）ファミリーのrBAT-b0,＋ATの変異はシスチン尿症の病因となり3）- 3) Chairoungdua, A., Segawa, H., Kim, J.Y., Miyamoto, K., Haga, H., Fukui, Y., Mizoguchi, K., Ito, H., Takeda, E., Endou, H., et al. (1999) Identification of an amino acid transporter associated with the cystinuria-related type II membrane glycoprotein. J. Biol. Chem., 274, 28845–28848.
，中性アミノ酸トランスポーターB0AT1の機能不全はハートナップ病を引き起こす4）- 4) Kleta, R., Romeo, E., Ristic, Z., Ohura, T., Stuart, C., Arcos-Burgos, M., Dave, M.H., Wagner, C.A., Camargo, S.R.M., Inoue, S., et al. (2004) Mutations in SLC6A19, encoding B0AT1, cause Hartnup disorder. Nat. Genet., 36, 999–1002.
．さらに，トランスポーターは疾患の治療標的にもなりうるため，糖尿病でのグルコーストランスポーターSGLT2や痛風における尿酸トランスポーターURAT1の阻害薬が近年上市されている5, 6）．また，HATであるCD98hc-LAT1は，がん診断と治療の標的として研究されている6）．加えて，薬物動態の観点からもトランスポーターは研究されている．
「transporter」という言葉を作った笠原らによる生化学的手法で機能解析が進められたグルコーストランスポーター7）などの研究に始まり，1990年代から2000年代にかけては，分子クローニング，ノックアウト（KO）細胞・動物などの遺伝子改変技術，イメージング，ゲノムワイド関連解析（GWAS）などにより研究が進み，多くの哺乳類トランスポーター分子が明らかにされ，基質認識の特性や細胞・生体内の局在などが明らかになってきた．一方で，生体におけるトランスポーター分子は生体恒常性を維持するために高い冗長性を持つ輸送システムを担っており，一つの分子をKOしても他の分子が補助的に機能して表現型が明確でないことがある．このような理由から，多くのトランスポーター分子の生理機能は未解明のままである．
そこで我々は，生体における輸送体の役割を明らかにするため，生命を分子から生体まで複数の生物学的階層に分けて解析する，多階層的アプローチを取り入れた．この手法の難しい点は各階層での解析結果をつなげることであるが，輸送体研究の場合は輸送基質がそれぞれの階層を連結し，我々研究者はその基質の動きに従うことで，異なる階層を自由に往来することが可能である（図1）．たとえば，GWASの低尿酸血症患者データからGLUT9が尿酸を輸送することを示した研究は，表現型から遺伝子変異の特定を経て分子の輸送機能解析を行っており，階層的アプローチの一例である8）- 8) Matsuo, H., Chiba, T., Nagamori, S., Nakayama, A., Domoto, H., Phetdee, K., Wiriyasermkul, P., Kikuchi, Y., Oda, T., Nishiyama, J., et al. (2008) Mutations in glucose transporter 9 gene SLC2A9 cause renal hypouricemia. Am. J. Hum. Genet., 83, 744–751.
．また，プロテオミクスによりHATファミリーのrBAT-AGT1を見いだし9）- 9) Nagamori, S., Wiriyasermkul, P., Guarch, M.E., Okuyama, H., Nakagomi, S., Tadagaki, K., Nishinaka, Y., Bodoy, S., Takafuji, K., Okuda, S., et al. (2016) Novel cystine transporter in renal proximal tubule identified as a missing partner of cystinuria-related plasma membrane protein rBAT/SLC3A1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, 775–780.
，その機能解析と局在情報からグルタミン酸輸送体との機能共役を示唆した研究も，分子レベルから分子複合体，組織レベルまで基質を軸に行き来することで行われた．前者は，単一の分子に焦点を合わせて階層をまたいでおり，後者は，複数の輸送体で構成される生体内の輸送システムを想定して進められている．こうした研究を経て，個々の輸送体分子の詳細な機能構造解析と細胞，組織・臓器，体液を対象とした網羅的な研究手法を組み合わせることで，先入観なく，生体内のさまざまな物質に対する輸送システムの全体像を捉え，それを構成するトランスポーターの詳細な機能を明らかにすることが可能な多階層的に解析するアプローチが確立された．輸送体研究のための多階層的アプローチにとって重要なことは，階層をつなげる基質の動きを明らかにする解析系である．この解析系は，研究対象によるが，主にメタボロミクスを基盤とする解析系と輸送体の輸送機能解析系からなる．これに加えて，プロテオミクスやトランスクリプトミクスなどを基盤とする，輸送体分子の変動や相互作用，局在を解析するための解析系も重要である．こうした解析系を組み合わせ，さまざまなオミクスにより得られたデータに先入観なしで導かれ，輸送体の生体内での機能や疾患ヘの関与が解明される．以下に，我々が行った多階層的アプローチからタイプの異なる二例を紹介する．
3. 多階層的アプローチによるD-セリン輸送システムの解明
生体内のアミノ酸のほとんどはL-アミノ酸であるが，一方で立体異性体であるD-アミノ酸も微量ながら存在する．D-アミノ酸は主に食物や腸内細菌から得られるが，D-セリンはラセマーゼにより生合成もされる．D-セリンは哺乳類大脳皮質において遊離セリン全体のうちの25％を占めており，NMDA受容体のコアゴニストとして知られている10）．さらに近年，D-セリンは急性腎障害（AKI）および慢性腎疾患（CKD）の有望なバイオマーカーとして注目されている11）．したがって，D-セリン量は酵素による合成・分解だけではなく腎臓のトランスポーターによる再吸収・排出によっても制御されていると考えられる．一方で，分解酵素D-アミノ酸オキシダーゼはKrebsによって90年近く前に発見されているにもかかわらず，末梢においてD-セリンを輸送するトランスポーターの分子実体は，ほとんど明らかになっていなかった．そこで，腎臓におけるD-セリン輸送システムを構成するトランスポーター分子を同定し，その全体像を明らかにすることを目指した12）- 12) Wiriyasermkul, P., Moriyama, S., Suzuki, M., Kongpracha, P., Nakamae, N., Takeshita, S., Tanaka, Y., Matsuda, A., Miyasaka, M., Hamase, K., et al. (2024) A multi-hierarchical approach reveals D-serine as a hidden substrate of sodium-coupled monocarboxylate transporters. eLife, 12, RP92615.
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腎臓におけるD-セリン輸送系を特定するため，マウスの虚血再灌流障害（IRI）をAKIモデルとして使用した．血漿および尿中の20種類のアミノ酸のL-およびD-異性体をキラルアミノ酸メタボロミクスで解析したところ，腎障害に伴ったD-/L-セリン比の変動パターンが他の小型アミノ酸と異なることから，D-セリン輸送を担うトランスポーター分子がl-セリンを輸送する小型アミノ酸輸送系とは同じでないことが示唆された（図2A）．次に網羅的膜プロテオミクスを用いて，腎尿細管の尿側アピカル膜を濃縮した刷子縁膜小胞（BBMV）を解析し，AKIモデルで変動する分子を探索した．バイオインフォマティクスを用いて同定された分子から325種類のトランスポーターを抽出し，そこからアミノ酸を含む有機物のトランスポーターを選択し，信頼性の高い局在情報をもとに絞り込んだ．さらに，中枢系でD-セリンを輸送するアミノ酸トランスポーターASCT2が同定されていたことから，この分子を基準として，より変動が大きかった分子を選別した（図2B）．選別した10種類のトランスポーター分子を，過剰なD-セリンが細胞毒性を示す性質を用いて構築したD-セリン輸送検出系でスクリーニングした結果，二つのモノカルボキシレート輸送体SMCT1およびSMCT2が候補分子として選ばれた（図2B）．SMCT1・SMCT2はNa＋／モノカルボン酸トランスポーターとして知られており，アミノ酸輸送能は報告されていなかった．そこで，SMCTsの詳細なD-セリン輸送機能の解析を試みた．ところが，HeLaやHEK293などの培養細胞株においてはASCT2が発現しており，SMCTsの輸送活性は確認できたものの，D-セリン輸送の背景値がきわめて高かった．そこで内在性のD-セリン輸送能をなくし正確な輸送活性を解析するため，精製SMCT1をリポソームに再構成したプロテオリポソームによる無細胞輸送解析系を用いたところ，L-セリンおよび他のアミノ酸よりもD-セリンを顕著に輸送した（図2C）．
次に，ASCT2およびSMCT1, SMCT2の腎近位尿細管における詳細な局在を，免疫蛍光法とsnRNA-seqデータにより明らかにした（図2E）．加えて，正常な腎臓およびAKIモデルから調製したBBMVを用いたex vivo輸送解析系により，それぞれの分子の正常および障害時でのD-セリン輸送システムへの寄与率を求めた（図2D）．その結果，正常な腎臓では，SMCT2はS1〜S2セグメントで，SMCT1はS3セグメントで高発現し，ASCT2は近位尿細管全体に存在するが存在量は低かった．そのため，SMCTsおよびASCT2のすべてがD-セリン再吸収に関与するものの，SMCT1およびSMCT2のD-セリン親和性が比較的低いため，全体としてのD-セリン再吸収量は低い（図2E：正常）．一方で，腎障害時においては，SMCT1およびSMCT2の発現量が劇的に減少するが，ASCT2量は増加する．ASCT2は高いD-セリン親和性を持ち，近位尿細管全域で発現しているため，全体としてD-セリン再吸収が増加する（図2E：腎障害）12）- 12) Wiriyasermkul, P., Moriyama, S., Suzuki, M., Kongpracha, P., Nakamae, N., Takeshita, S., Tanaka, Y., Matsuda, A., Miyasaka, M., Hamase, K., et al. (2024) A multi-hierarchical approach reveals D-serine as a hidden substrate of sodium-coupled monocarboxylate transporters. eLife, 12, RP92615.
．以上のように，メタボロミクス・プロテオミクスを組み合わせて候補分子を選択し，無細胞再構成系で分子の輸送機能を明らかにし，ex vivoで複数のトランスポーターが関わる輸送システムとして解析することで，腎臓におけるD-セリン輸送（再吸収）システムのモデルを構築した．
4. 多階層的アプローチによるシスチン尿症の病因解明
次に，蓄積された基礎および臨床研究の成果を利用した研究の例を簡単に紹介する．
HATsは，アミノ酸の吸収や再吸収など，さまざまな活動に重要な役割を果たすアミノ酸トランスポーターファミリーで，輸送機能を持つトランスポーター分子と糖タンパク質の二つのサブユニットで構成される6）．腎近位尿細管などのアピカル膜側に局在するrBAT-b0,＋AT複合体は，トランスポーターであるb0,＋ATと糖タンパク質rBATからなり，この複合体の変異は，シスチンと塩基性アミノ酸の過剰排泄を特徴とする腎疾患であるシスチン尿症を引き起こす．数多くの変異が解析されていたものの，ヨーロッパに多いrBAT T216Mの病因メカニズムは不明であった13）- 13) Chillarón, J., Font-Llitjós, M., Fort, J., Zorzano, A., Goldfarb, D.S., Nunes, V., & Palacín, M. (2010) Pathophysiology and treatment of cystinuria. Nat. Rev. Nephrol., 6, 424–434.
．最近，我々はマックスプランク研究所・李勇燦博士らとの共同研究により，rBAT T216Mの病態発生機序とHATsの膜局在化機序の一端を解明した14）- 14) Lee, Y., Wiriyasermkul, P., Kongpracha, P., Moriyama, S., Mills, D.J., Kühlbrandt, W., & Nagamori, S. (2022) Ca2+-mediated higher-order assembly of heterodimers in amino acid transport system b0,+ biogenesis and cystinuria. Nat. Commun., 13, 2708.
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我々が以前に解析したHATsであるCD98hc-LAT1複合体は単一の二量体であったが15）- 15) Lee, Y., Wiriyasermkul, P., Jin, C., Quan, L., Ohgaki, R., Okuda, S., Kusakizako, T., Nishizawa, T., Oda, K., Ishitani, R., et al. (2019) Cryo-EM structure of the human L-type amino acid transporter 1 in complex with glycoprotein CD98hc. Nat. Struct. Mol. Biol., 26, 510–517.
，今回rBAT-b0,＋AT複合体のクライオ電子顕微鏡構造解析を行ったところ，rBAT-b0,＋ATは超二量体構造（super-dimer；ヘテロ二量体のホモ二量体）をとっていた．構造を詳細に観察したところ，rBATに特徴的な部位であり，二量体どうしが結合する領域の近傍にCa2＋結合部位が存在した（図3A）．そこで，経時的にrBAT-b0,＋ATの二量体や超二量体を定量し生合成過程を解析するため，パルスチェイス実験を行った．小胞体（ER）内へのCa2＋流入阻害薬なども用いた結果，ER内Ca2＋がrBAT-b0,＋ATの超二量体形成に必須であり，アピカル膜への局在，ひいては輸送機能の発現に必要であることが明らかになった（図3B）．極性細胞において，CD98hcを含むHATsはバソラテラル膜に局在することから，rBATによる超二量体構造がアピカル膜局在に重要だと考えられる．さらに，rBATのT216残基は，このCa2＋結合部位に近接していた．T216M変異によりCa2＋結合が阻害され，超二量体が形成されず，rBAT-b0,＋ATがERからアピカル膜に行くことができなくなり，その結果，シスチン尿症を引き起こすことが示唆された14）- 14) Lee, Y., Wiriyasermkul, P., Kongpracha, P., Moriyama, S., Mills, D.J., Kühlbrandt, W., & Nagamori, S. (2022) Ca2+-mediated higher-order assembly of heterodimers in amino acid transport system b0,+ biogenesis and cystinuria. Nat. Commun., 13, 2708.
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輸送体のための多階層的アプローチは，最先端のマルチオミクスに加え，古典的ともいえる生化学に基づく輸送解析を用いることで，生体から分子レベル，それぞれで解析を行い，そして輸送体の基質により各階層を連結することで進められる．このアプローチは，生理的な状態や病態におけるさまざまな輸送システムを研究するための枠組みを提供する．これまで500近いSLCトランスポーターが同定されているが，約30％がオーファン分子であり，さらによく研究されているトランスポーターにも未知の生理的基質が存在する可能性がある．この多階層的アプローチによって，生体内の複雑な輸送システムの解明が進むと期待される．
本稿で二例目に紹介した研究においては，分子レベルからタンパク質複合体，細胞レベルに焦点を当てて解析を行った．しかしながら，これは多くの研究者による患者データなど生体レベルの解析があっての研究成果である．その点において，ほとんどの生命科学研究は多数の研究者らによる多階層的アプローチを経たものといえる．一方で，さまざまなオミクス解析が比較的身近になり，単独グループ，ないしは共同研究グループで多階層的アプローチのすべてを実施することも可能になってきた．また，近年は豊富な公開データベース上の情報が利用可能であり，AIによるメタデータ解析がさらなる価値を提供する．したがって，多階層的アプローチが，これまで以上に必要になるだろう．そうした状況で，分子や分子複合体の機能を丁寧に解析することが可能な生化学は，いっそう重要になっていくと確信している．
引用文献References
1) César-Razquin, A., Snijder, B., Frappier-Brinton, T., Isserlin, R., Gyimesi, G., Bai, X., Reithmeier, R.A., Hepworth, D., Hediger, M.A., Edwards, A.M., et al. (2015) A call for systematic research on solute carriers. Cell, 162, 478–487.
2) Meixner, E., Goldmann, U., Sedlyarov, V., Scorzoni, S., Rebsamen, M., Girardi, E., & Superti-Furga, G. (2020) A substrate-based ontology for human solute carriers. Mol. Syst. Biol., 16, e9652.
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15) Lee, Y., Wiriyasermkul, P., Jin, C., Quan, L., Ohgaki, R., Okuda, S., Kusakizako, T., Nishizawa, T., Oda, K., Ishitani, R., et al. (2019) Cryo-EM structure of the human L-type amino acid transporter 1 in complex with glycoprotein CD98hc. Nat. Struct. Mol. Biol., 26, 510–517.
著者紹介Author Profile
ウィリヤサムクン パッタマ岩手大学農学部応用生物化学科食品分子システムズバイオロジー研究室 准教授．博士（医学）．
略歴2011年杏林大学大学院博士課程修了．11年大阪大学大学院医学系研究科研究員，14年Columbia University研究員を経て，18年奈良県立医科大学助教．20年東京慈恵会医科大学助教．23年より現職．
研究テーマシステムバイオロジーを用いて栄養素や代謝物などのトランスポーターを研究しています．
趣味旅行，ランニング．
永森 收志（ながもり しゅうし）東京慈恵会医科大学SI医学応用研究センター センター長，教授．博士．
略歴東京大学大学院博士課程修了，UCLAおよびHHMI研究員，大阪大学大学院医学系研究科准教授，奈良県立医科大学教授などを経て，2020年より東京慈恵会医科大学SI医学応用研究センターおよび臨床検査医学講座所属．
研究テーマ輸送システムの解明．
趣味走ったり，スベったり，泳いだり，その他色々．
