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ミトコンドリアは細胞内共生した細菌を起源とするオルガネラで，独自にミトコンドリアDNA（mtDNA）を内包し，エネルギー産生，代謝，シグナル伝達，細胞死など，生命活動に不可欠な役割を担っている．ミトコンドリアは，感染に対する防御や炎症制御のハブとして機能していることが明らかにされつつある．実際，ヒト炎症性疾患において，ミトコンドリア由来の活性酸素種（mROS）や細胞内外へ漏出したmtDNAが病態に関与することが報告されている1）．本稿では，ミトコンドリアの恒常性維持機構の破綻に伴って漏出したmtDNAによる炎症誘導とヒト疾患との関連について，筆者らの研究を含めて紹介する2）．
ミトコンドリアはinner mitochondrial membrane（IMM）とouter mitochondrial membrane（OMM）の二重膜からなる非常に動的なオルガネラで，絶えず分裂（fission）や融合（fusion）を繰り返している．エネルギー需要の亢進や糖分解の低下を来すと，Mitofusion1/2（Mfn）によりOMMが，Opa1によりIMMが融合し，ミトコンドリアの容量および機能が亢進する．一方，古くなったミトコンドリアや損傷を受けたミトコンドリアは，正常なミトコンドリアと融合して補修されるか，ミトコンドリア膜へDynamin-related protein 1（Drp1）がリクルートされ正常なミトコンドリアから切り離され（fission），マイトファジーにより隔離されリソソームによって分解される．同時にミトコンドリア合成が誘導されミトコンドリアの質と量が維持される3）．マイトファジーは主にPTEN誘導キナーゼ1 PINK1とE3ユビキチンキナーゼParkinにより制御を受ける．すなわち，ミトコンドリアOMMに局在するPINK1は通常プロテアーゼによって分解されるが，ミトコンドリア障害により膜電位の低下が起こると，PINK1の分解が阻害されてPINK1の蓄積が生じ，Parkinがリクルートされる．ParkinによりOMMのタンパク質がユビキチン化され，OPTN, NDP52等を介して隔離膜上のLC3と結合してミトコンドリアは内包され，その後リソソームにより分解される4）．こうしてミトコンドリアの恒常性が維持されている．
感染やストレスに曝露されるとミトコンドリアの膜電位が低下し，ミトコンドリアの断片化，mROS産生，ミトコンドリアDAMPs（damage-associated molecular patterns）の放出等が起こり，炎症が惹起される．その際，ミトコンドリアは炎症誘導シグナルのハブとして機能するほか，インフラマソームの活性化を経て細菌感染による炎症性細胞死であるピロトーシスの誘導や，チトクロムCの放出により非炎症性細胞死であるアポトーシスの誘導にも関与する（図1）5）．
ウイルス感染においてミトコンドリアは炎症応答シグナルのプラットホームの役割を果たす．すなわち，感染したウイルス由来のRNAは，細胞質内に存在しCaspase-recruitment domain（CARD）ドメインとRNAヘリカーゼドメインを有するmelanoma differentiation-associated gene 5（MDA-5）やretinoic acid-inducible gene I（RIG-I）により認識され，ミトコンドリア膜上に存在するmitochondrial antiviral signaling protein（MAVS）とCARDドメインを介して複合体を形成する．活性化したMAVSは，TNF受容体関連分子であるTNF receptor-associated factor（TRAF）や，TNF receptor-associated death domain（TRADD）をリクルートし，ミトコンドリア・シグナルソームと呼ばれる分子重合体を形成する．この集合体をプラットホームとして，I型IFN（FN-I）産生経路およびNF-κB経路が活性化され，抗ウイルス応答が誘導される．
ミトコンドリア傷害により電子伝達系の障害が生じると，mROSや酸化mtDNAの細胞質内への漏出が生じNLRP3インフラマソームが活性化する．NLRP3インフラマソームはNACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3（NLRP3），Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD（ASC），Pro-Caspase-1による複合体で，mROSおよび，mROSによって酸化修飾されたmtDNAによって活性化されて活性化型Caspase-1を生成する．活性化型Caspase-1は，炎症性サイトカインであるpro-IL-1βやpro-IL-18を切断して活性化型IL-1βやIL-18を産生するとともに，膜孔形成前駆体分子であるGasdermin-D（GSDMD）を切断し，N末断端の重合により細胞膜に膜孔を形成する．膜孔から活性化IL-1β, IL-18が細胞外へ放出されて炎症が誘導されるとともに6），ピロトーシスと呼ばれる細胞死が誘導される．その際に細胞質内からDAMPsが細胞外に漏出し炎症が誘導される．なお，NLRP3インフラマソーム形成には，シグナル分子の集積したmitochondria associated membrane（MAM）と呼ばれる小胞体由来膜がミトコンドリア近傍にリクルートされ，足場として機能することも報告されている7）．
損傷したミトコンドリアはマイトファジーにより隔離・分解される．実際，マイトファジーによる変異mtDNAの除去，Drp1欠損マクロファージにおける炎症性サイトカイン産生の亢進，運動疲弊やmtDNA変異誘導によるミトコンドリアストレスをかけたParkinやPINK1欠損マウスにおける炎症性サイトカインの過剰産生，薬剤や遺伝子欠損によるオートファジー障害により炎症が亢進するといった知見が集積しており，ミトコンドリアの品質管理機構の破綻によって炎症が誘導されていることがうかがえる8）．一方，損傷したミトコンドリアはミトコンドリア透過性遷移孔（mitochondrial permeability transition pore：mPTP）からチトクロムcを放出して，アポトーシス関連Caspaseを活性化してアポトーシスを誘導する．アポトーシスは炎症を誘導しない細胞死であり，アポトーシス関連Caspaseは自然免疫系シグナル分子を分解して炎症を抑制することが報告されており，炎症性細胞にアポトーシスを誘導することで炎症を鎮静化し，個体の生存戦略が図られていると考えられる．
mtDNAは全長約16 kbpの二本鎖環状DNAで，酸化的リン酸化関連タンパク質，リボソームRNA，トランスファーRNAなど13の遺伝子がコードされ，transcription factor A, mitochondrial（TFAM）と結合してミトコンドリア内に存在している．ミトコンドリアが傷害されると，mtDNAは細胞質ゾルへ漏出する．漏出したmtDNAは二本鎖DNA（dsDNA）センサーであるcyclic GMP-AMP synthase（cGAS），エンドソームに存在してDNAの非メチル化CpGを認識するToll-like receptor（TLR）9，そしてNLRP3によって認識され，IFN-I, IL-6, TNF-α, IL-1βなどの炎症性サイトカイン産生を誘導する．また，mtDNAは細胞外にも漏出し周囲の細胞を活性化して炎症を増強する1）．
ストレスによりミトコンドリア膜電位が低下すると，IMMにあるmPTPが開き，Bcl-2関連Xタンパク質（BAX）とBcl-2相同アンタゴニスト／キラー（BAK）がオリゴマー化してOMMの開裂が生じ，IMMが細胞質ゾル内に突出してミトコンドリア内容物が細胞質ゾルへ漏出する．また，酸化ストレス下では，OMMに局在する電位依存性アニオンチャネル1（VDAC1）のオリゴマー化により孔が形成されてmtDNAが漏出することが知られている．また，外方に突出したミトコンドリア膜のsheddingによりmitochondrial-derived vesicle（MDV）が形成されてmtDNAが漏出することも報告されている9）．一方，筆者らは，Caspase-1とGSDMDを欠損させると，インフラマソームの活性化によるmtDNAの細胞質ゾルへの漏出が観察されなくなり，野生型細胞では刺激後ほどなくしてGSDMDのN末断端がOMMに集積してくることを見いだした．ミトコンドリア傷害が生じると膜の反転によりIMMに局在するカルジオリピンがOMMに露出すること，GSDMDのN末断端はカルジオリピンに結合親和性を有することが報告されており，GSDMDによって開けられたミトコンドリア膜孔からmtDNAが細胞質ゾルへ漏出していることが示唆された2）．
一方，mtDNAの細胞外への漏出に関しては，クロマチンネットの放出を伴うネトーシスと呼ばれる細胞死の際に好中球からmtDNAが細胞外に放出されることが知られている．筆者らは免疫細胞においてエクソソームを介してmtDNAが細胞外へ放出されることを見いだした．免疫細胞の中でも好中球やリンパ球を刺激後に培養上清中に漏出したmtDNAは，DNA分解酵素処理にて完全に分解されたが，単球系細胞由来のmtDNAはDNA分解酵素単独では分解されず，界面活性剤で前処理することにより分解された．このことから，免疫細胞の種類によってmtDNAが放出される機序が異なり，とりわけ単球系細胞では膜小胞に包まれてmtDNAが放出されている可能性が示唆された．単球系細胞にアポトーシスを誘導するとmtDNAは16,000×gで単離されるApoptosis-derived membrane vesicles（AdMVs）と呼ばれる膜小胞中に存在し，ピロトーシスを誘導すると100,000×gで単離される極微小の膜小胞，すなわちエクソソーム中に存在することを見いだした．このことから，単球系細胞では，ミトコンドリア傷害–インフラマソーム活性化–ピロトーシスの過程でmtDNAがエクソソームにソートされることが示唆された2）．エクソソームは30～100 nmの極微小の細胞外膜小胞である．早期エンドソームに由来するmulti-vesicular body（MVB）の中へ膜が突出してMVB内にintra-luminal vesicle（ILV）と呼ばれる膜小胞が形成される．通常MVBはリソソームと融合して分解されるが，MVBが形質膜と融合すると細胞外にILVが放出され，エクソソームと呼ばれる細胞外膜小胞となる．エクソソームはエンドサイトーシス等によって別の細胞に取り込まれ，エクソソーム中に存在するmRNA, miRNA，タンパク質などのドナー細胞由来の情報がアクセプター細胞に伝えられる10）．そこで筆者らは，漏出したmtDNAがエクソソームにソートされるか，mtDNAをdsDNAに特異的に取り込まれるPicoGreen, ILVを小胞輸送制御因子のESCRT-I複合体分子であるTumor susceptibility gene 101 protein（Tsg101）により可視化して検討した．THP1細胞にピロトーシスを誘導すると，細胞質ゾルに漏出したmtDNAが観察され，漏出したmtDNAはILVと共局在した．また電子顕微鏡にてMVB内のILVにdsDNAのdepositionが観察された．さらにILV産生を阻害するdimethyl amiloride（DMA）で処理すると，エクソソームに含まれるmtDNA量は減少した．一方，GSDMD欠損細胞ではピロトーシスの誘導によりILVのpuncta形成が認められたのに対して，Caspase-1欠損細胞ではILVのpuncta形成が起こらず，Caspase-1はGSDMD非依存的にILVの形成にも関与していることが示唆された．以上から，単球系細胞にミトコンドリア傷害が生じると，インフラマソームが活性化し，その後のGSDMDの切断によってミトコンドリア膜に孔が開いてmtDNAが細胞質ゾルに漏出し，それらがILVに取り込まれてエクソソームとして細胞外に放出される，という機序が働いていることが明らかとなった（図2）2）．
次に筆者らは，エクソソームによる炎症誘導について検討した．まず，ピロトーシスした細胞から単離したエクソソームをマウスの腹腔内や関節腔に投与すると好中球や炎症性単球の浸潤が誘導され，ヒト末梢血単核球（PBMC）やヒト単球系細胞株のTHP1細胞に投与すると，サイトカイン産生が強く誘導されたが，mtDNAの受容体であるNLRP3やTLR9を欠損させたTHP1細胞ではサイトカイン産生は誘導されなかった．また，THP1細胞を低濃度エチジウムブロマイドで培養しmtDNAをなくしたρ0細胞から単離したエクソソームでは炎症誘導は起こらず，エクソソーム中のmtDNAが炎症誘導に直接関与していることが確認された．次に，mtDNAのエクソソーム内包化による炎症誘導効果を検証する目的で，単離したmtDNAをmtDNA単独，あるいはリポソームで包んでマウスの関節腔やPBMCに投与した．mtDNA単独に比べてリポソームによる内包化により炎症が強く誘導され，膜小胞に内包されることで細胞内のmtDNA受容体に効率よくmtDNAが届けられ，その結果炎症が強くなるものと思われた（図2）．また，前述のエクソソーム産生を阻害するDMAはインフラマソーム活性阻害効果を有しないが，尿酸関節炎モデルマウスにDMAを前投与するとCaspase-1阻害剤と同程度に関節炎を抑制した．従来尿酸関節炎はインフラマソームの活性化に伴うIL-1βが炎症の担い手と考えられていたが，mtDNA内包エクソソームも炎症誘導に重要な役割を担っていることが示唆された2）．
近年，漏出したmtDNAとヒト疾患，特に，全身性エリテマトーデス（SLE）11），関節リウマチ（RA）12），ベーチェット病（BS）2），好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（EGPA）13）といった自己免疫疾患や，ARDSなどの炎症性疾患，動脈硬化などの慢性炎症との関連が報告されている14）．筆者らは膠原病患者血清中のmtDNA量を定量PCR法にて比較し，BS患者血清でmtDNA量が非常に高いことを見いだした．BS患者血清中のmtDNAはエクソソーム中に存在することがわかり，一方でSLEではエクソソームではなくAdMVs中に存在していたことから，疾患によりmtDNAがソートされる膜小胞が異なることが示唆された．またBS由来単球は，LPSやATP刺激により，Caspase-1の活性化，IL-1βの産生亢進，mROS産生亢進，ミトコンドリア膜電位の低下，LDHの細胞外への漏出亢進を認め，mtDNA内包エクソソームの細胞外放出も亢進していた．また，BS由来エクソソームのマウスへの投与により炎症細胞浸潤による関節炎やぶどう膜炎が誘導された．したがって，BS患者の単球系細胞では，ミトコンドリア傷害–インフラマソーム活性化–ピロトーシス誘導の一連の経路が活性化しており，その結果，エクソソームを介して細胞外にmtDNAが放出され炎症が増強することが示された（図3）2）．
（A）膠原病における血清mtDNA量．HC：健常コントロール，BS：ベーチェット病，RA：関節リウマチ，SLE：全身性エリテマトーデス，SjS：シェーグレン症候群，AAV：ANCA関連血管炎，PM/DM：多発性筋炎／皮膚筋炎，SSc：全身性強皮症．（B）BS由来エクソソームの腹腔内投与による炎症誘導．（C）実験的自己免疫性網膜ぶどう膜炎モデルマウスへのBS由来エクソソームの静脈内投与による網膜ぶどう膜炎の誘導．
本稿では，ミトコンドリアによる恒常性維持機構とその破綻によるmtDNAの漏出，mtDNAによる炎症誘導とヒト疾患との関わりについて，特に，最近筆者らが明らかにした，ピロトーシスの際にエクソソームに包まれてmtDNAが放出されて炎症が増強すること，ベーチェット病において，そのプロセスの亢進が起こっていることについて紹介した．mtDNAのモニタリングがバイオマーカーとして有用か，mtDNAの漏出や誘導炎症機序が疾患ごとに異なるか，mtDNAの質的な違いがあるか，mtDNAの漏出を標的とした治療法の開発など，今後の研究の発展が期待される．
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国立病院機構大阪南医療センター臨床研究部 免疫異常疾患研究室室長，リウマチ・膠原病内科医長，大阪大学医学系研究科呼吸器・免疫内科 招聘教授．博士（医学，大阪大学大学院医学系研究科）．
1998年山形大学医学部卒業，2007年大阪大学大学院医学系研究科博士課程修了，07～10年学振研究員（PD1），10～15年大阪大学iFReC感染病態分野特任助教，12～14年Harvard大学医学部分子免疫学研究員，15～22年大阪大学医学部呼吸器・免疫内科助教，22年大阪大学医学部呼吸器・免疫内科講師，23年4月より現職．
研究テーマと抱負クリニカルクエッションを端緒に，自己免疫疾患や自己炎症性疾患の病因や病態について解明したい．また，リソソームによる炎症・細胞移動制御機構を明らかにし，免疫・炎症について理解を深めたい．
ウェブサイトhttps://takamatsu-lab.com/
趣味スキー，野良仕事．
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