生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

神経伝達物質は，シナプス前末端からシナプス間隙に放出され，シナプス後末端の特異的受容体に結合して，電気生理学的情報を伝達する．遊離した残りの神経伝達物質は，神経細胞膜やアストロサイト膜に埋め込まれたトランスポーターを介して，シナプスの細胞質やシナプスを包むアストロサイトに取り込まれる^1）．トランスポーターを介した神経伝達物質の除去の仕組みは厳密に制御されている．過剰あるいは漏出した神経伝達物質は，不適切な神経回路を活性化し，精神疾患等の原因となる．しかし，これらの機能的に重要なトランスポーターが，どのようにシナプスに局在しシナプス周辺領域で機能するかは，いまだほとんどわかっていなかった．

Down syndrome cell adhesion molecule（DSCAM）は，免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞接着分子で，神経回路の形成や機能のさまざまな側面に必須である^2）．これまでの研究により，軸索誘導や樹状突起形成，シナプス接着などの細胞機能において，ショウジョウバエのDscamの選択的スプライシング変異体やマウスのDscamのパラログが，隣接細胞間でホモフィリックに相互作用する（トランスホモフィリック結合）ことにより，軸索誘導や樹状突起形成，シナプス接着などに重要な役割を果たすことが明らかにされてきた．また，Netrin-1およびその受容体（DCC）がDSCAMの細胞外ドメインと三者複合体を作ることが，神経発生における神経突起の伸長と軸索投射を媒介することが示唆されている^3）．しかし，自閉スペクトラム症や統合失調症の患者に存在するDscamの遺伝子変異^{4, 5）}は，ホモフィリック結合やNetrin-1/DCC結合とは異なる細胞外ドメインでも見つかっているため，未報告のヘテロフィリック結合の存在とその重要性を示唆している．本稿では，小脳発生期のグルタミン酸トランスポーターGLASTを介したDSCAMのシナプス形成における重要な機能について，我々の最近の研究成果を基に概説する．

まず，成体マウス小脳の各細胞タイプにおけるDscam転写産物の発現プロファイルを，Kozarevaら^6）によって公開されたsingle-nucleus RNA-seqデータセットを用いて解析した．顕著な発現がプルキンエ細胞とオリゴデンドロサイト前駆細胞で観察されたが，バーグマングリア（小脳アストロサイトの一種）と顆粒細胞ではほとんどみられなかった．次に，生後20日のマウス小脳を用いて粗シナプス画分を調製し，他のシナプスタンパク質であるGluD2やPSD95と同様に，DSCAMも粗シナプス画分に分画されることを確認した（図1a）．さらに，三つの連続したALFA tagでタグ付けされたDSCAMタンパク質を発現するノックインマウス系統を作製した（図1b）．Dscam^ALFA/ALFAマウスでは，DSCAM-ALFAのシグナルは，プルキンエ細胞の樹状突起構造（Calbindin陽性構造）に局在した（図1bの黄色矢頭）．さらに，DSCAM-ALFAシグナルの一部は，PSD95（シナプス後部マーカー），vGluT1（平行線維シナプス前部マーカー），vGluT2（登上線維シナプス前部マーカー）の近傍にみられた（図1b）．これらの結果は，DSCAMがプルキンエ細胞のシナプスに局在していることを示唆している．

マウスの小脳神経系の発達は，シナプス形成，樹状突起形成，刈り込みを含む神経回路形成のよいモデルである^{7, 8）}．小脳のプルキンエ細胞では，近位樹状突起を1本の強化された登上線維が独占するのに対し，遠位樹状突起を支配する顆粒細胞からは数十万の平行線維が投射される．マウスの生後0～7日目には，下オリーブ核からの軸索である複数の登上線維が一つのプルキンエ細胞の細胞体を支配し，シナプス接触を行う．その後，1本の登上線維が神経活動に応じて強化され，プルキンエ細胞の一次樹状突起上に転移して，生後9日以降の段階でより多くのシナプスを作る（図1d，野生型参照）．

図1 DSCAMのシナプス局在と登上線維シナプス形成に与える影響

（a）小脳組織を破砕し（粗抽出画分），さらに細胞分画法を使って細胞質画分，シナプスを多く含む画分（粗シナプス画分）に分離した上で，その中に含まれるタンパク質について，ウエスタンブロット法で調べたもの．粗シナプス分画には，シナプス分子として知られるGluD2やPSD95が予想どおり濃縮されている．GLASTもシナプスに濃縮されている．この図では，DSCAMタンパク質もシナプスに濃縮されることが示されている．（b） ALFAタグを融合したDSCAM（DSCAM-ALFAタンパク質）を発現するゲノム編集マウス（Dscam^ALFA/ALFA）を作製した．このマウスの生後14日の小脳組織に対して，ALFAタグおよびCalbindin（プルキンエ細胞マーカー）とPSD95（興奮性シナプスマーカー）に対する抗体による免疫組織化学染色を行った．二色のシグナルが重なっている部位は，DSCAM-ALFAタンパク質が興奮性シナプスに存在することを意味している（黄色矢頭）．スケールバー，5 µm. （c） Dscam機能欠失マウス（Dscam^del17del17）の生後30日目の小脳組織をプルキンエ細胞マーカー（Calbindin）と登上線維シナプスマーカー（vGluT2）で免疫染色した画像．Dscam機能欠失マウスでは，vGluT2の顆粒状の染色が減少している．スケールバー，50 µm. （d） Dscam機能欠失マウスによる小脳のシナプス形成障害の模式図．プルキンエ細胞に沿って転移する登上線維シナプスは，Dscam機能欠損マウスで傷害されており，シナプス（赤紫色のコブ状の形態）の数の減少が観察される．平行線維シナプス（薄紫色のコブ）は，プルキンエ細胞体から遠いエリアに形成され，Dscam機能欠損マウスでは部分的な増加が観察される．一部の図はBioRenderにて作成された．

このような小脳のシナプス形成におけるDSCAMタンパク質の機能的役割を理解するために，Dscam遺伝子の17番目のエキソンに38 bpの欠失を持つ自然機能欠損変異マウス（Dscam^del17/del17）の小脳構造を調べた．この小脳スライスをvGluT2で免疫組織化学的に解析したところ，Dscam^del17/del17小脳では，野生型に比べてvGluT2陽性のシナプス前部が有意に減少していた（図1c）．生後の小脳の観察から，DSCAMが生後22日以降の登上線維シナプス形成と転移において重要な役割を果たしていることを見いだした．

生後30日のDscam^del17/del17マウスの登上線維シナプス機能を評価するために，プルキンエ細胞の登上線維シナプスにおける興奮性シナプス後電流（登上線維EPSC）を全細胞パッチクランプ記録で評価した．Dscam^del17/del17小脳を刺激して誘発された登上線維EPSCは正常なペアパルス抑制（2回の連続刺激を与えると2回目の電流が抑制されること）を示し，シナプス前部の機能はほとんど影響を受けていないことが示された．平行線維EPSCに関しては，野生型マウスとDscam^del17/del17マウスの間で調べたどのパラメータにも変化はなかったが，回復勾配の微妙な遅れが観察された．そこで，グルタミン酸トランスポーターによるグルタミン酸除去機能を測定するために，シクロチアジド（CTZ）を用いた．CTZはAMPA受容体の脱感作を低下させるため，細胞外グルタミン酸量に応じたEPSCが測定可能となる．CTZ存在下において，野生型マウスとDscam^del17/del17マウスの平行線維EPSCの振幅比に有意差が検出されたが，登上線維EPSCでは検出されなかった．したがって，Dscam^del17/del17マウスでは平行線維シナプスからのグルタミン酸除去が部分的に機能低下していることが示唆された．

これまでの研究で，小脳のアストロサイト型グルタミン酸トランスポーターGLASTが，伝達物質放出後の初期段階でグルタミン酸の取り込みに寄与していることが示されている^9）．GLAST欠損小脳では，CTZ投与により初期段階の平行線維EPSCの振幅が増大し^9），Dscam^del17/del17マウスで観察されたように，分子層における登上線維シナプスの転移が減少した．これらの電気生理学的データとこれまでのGLAST欠損小脳のデータを考えると，Dscam^del17/del17マウスでは，バーグマングリアのGLASTによる平行線維シナプスでのグルタミン酸除去が障害されている可能性が浮上した．

GLASTがシナプス間隙周辺に局在できなくなるとシナプス間隙からのグルタミン酸除去が障害され，シナプス形成と機能に異常が生じる^10）．そこで，電子顕微鏡と免疫電子顕微鏡を用いて，生後30日後の野生型マウスとDscam^del17/del17マウスの平行線維シナプスの超微細形態とGLAST局在を観察した．免疫電子顕微鏡解析を用いてGLAST分子からシナプス後部の端までの距離を調べたところ，変異体の距離は野生型マウスのそれよりも有意に長かった．これらの結果は，DSCAMの欠損がGLASTのシナプス間隙からの脱局在を引き起こしたことを示唆した．

次に，DSCAMがGLASTの局在を制御するメカニズムを調べた．マウス小脳のシナプス画分（図1a）を用いて，抗GLASTと抗DSCAM抗体を用いた免疫沈降実験を行い，DSCAMとGLASTの結合について検討した（図2a）．その結果，GLASTとDSCAMが相互に共免疫沈降することが確認された．また，DSCAM-ALFAとGLASTのタンパク質が隣り合って局在していることを見いだした（図2b）．

図2 DSCAMとGLASTの相互作用とシナプス形成における効果

（a）成体マウス小脳の抽出液に対して抗DSCAMおよび抗GLAST抗体を用いた免疫沈降法（IP：immunoprecipitation）を行い，ウエスタンブロット法を行った．DSCAMとGLASTが結合することが示された．（b） DSCAM-ALFAが発現するマウス（Dscam^ALFA/ALFA）の生後14日目小脳に対して免疫組織化学染色を行った．ALFAタグとGLASTのシグナルが隣接していることから，DSCAM-ALFAとGLASTが共局在することがわかる（黄色矢頭）．スケールバー，5 µm. （c） GLASTを活性化することが報告されているリルゾール投与後の登上線維シナプス密度の計測結果を示したグラフ（斜線入り：リルゾール投与群）．グラフ左側はプルキンエ細胞下方（近位），右側はプルキンエ細胞上方（遠位）．リルゾール投与により，近位のvGluT2の顆粒数（シナプス数）が上昇する．（d） DSCAMによるGLASTのシナプスへの集積メカニズム．（左図）野生型マウスでは，シナプスのプルキンエ細胞膜上に配置されたDSCAMが，その細胞外領域を使ってバーグマングリア細胞膜上のGLASTと結合し，GLASTをシナプスへと集積させる．これによって，シナプス間隙の余剰グルタミン酸が効率よく除去される．（右図）DSCAMの機能が失われる（Dscam機能欠損マウス）と，GLASTのシナプスへの集積が損なわれるため，シナプスおよびその周辺に過剰グルタミン酸が漏出し，適切なシナプス機能が障害される．一部の図はBioRenderにて作成された．

これまでのDscam^del17/del17マウスを用いた研究では，DSCAMを発現しているどの細胞が，登上線維シナプスの形成と転移に関与しているのかは不明である．そこで，Dscam-floxed（Dscam^flox）マウスをさまざまなタイプのCre系統と交配させることにより，後脳細胞特異的なDscamコンディショナルノックアウト（cKOマウスを複数作製した．生後30日マウス小脳スライスの免疫組織化学的解析から，En1Cre-cKO, Pcp2Cre-cKO, Ptf1aCre-cKOの3系統のマウスでは，対照のDscam^flox/floxマウスと比較して，vGluT2陽性の顆粒の数が有意に減少していた．3系統のマウスでは共通してプルキンエ細胞においてDSCAMの発現が低下する．これらの結果から，プルキンエ細胞に発現するDSCAMは，生後小脳発達過程における登上線維シナプス形成に重要であることが示唆された．

Dscam変異マウスにおけるグルタミン酸トランスポーターの機能低下のシナプス形成における関与を調べるため，グルタミン酸トランスポーターを活性化すると報告されているリルゾール（筋萎縮性側索硬化症の治療薬）を用いた^11）（図2c）．GLASTは，DSCAMの機能低下によりシナプス間隙から脱局在するが，一部のGLASTはシナプス間隙に残っているため，このGLASTを過剰に活性化することでグルタミン酸除去能を回復させ，シナプス形成に影響があるか検証した．Pcp2Cre-cKOマウス（プルキンエ細胞特異的Dscam変異マウス）にリルゾールを投与したところ，分子層の近位領域における登上線維シナプス形成が一部ではあるが有意に回復した（図2c）．これらの結果は，おそらくGLASTのシナプス周辺領域からの脱局在によって引き起こされるシナプス間隙での過剰な遊離グルタミン酸が，生後小脳発達過程における登上線維シナプス形成障害の原因であることを示唆している．

プルキンエ細胞におけるDSCAMの役割をさらに明らかにするために，小脳依存性の運動学習を研究する実験モデルである水平視運動反応（hOKR）の適応を調べた^12）．静止動物の周囲でスクリーンを連続的に振動させると，コントロールのDscam^flox/floxマウスではhOKRの振幅幅が増大し，運動学習が成立した．訓練前ではPcp2Cre-cKOマウスでも同様にhOKRが観察されたが，60分間の訓練中，Pcp2Cre-cKOマウスでは振幅幅が増加しなかったことから，運動学習が著しく障害されていることが示された．これらの結果は，発達期にプルキンエ細胞に発現するDSCAMタンパク質が，成体小脳における運動学習などの正常な登上線維機能に必要であることを示している．

三者間シナプスにおいて，アストロサイトが神経シナプスを選択的に認識し機能することは重要であるにもかかわらず，アストロサイトとシナプスタンパク質間のシグナル伝達に関するデータは限られている^13）．興味深いことに，アストロサイトとニューロンの接触を介した情報伝達のほとんどは，ガンマプロトカドヘリンやNRCAMなどの細胞接着分子のホモフィリック結合を仲介し，興奮性シナプスと抑制性シナプスの両方の形成を促進する．Ephrin A3/Eph4AとNeuroligin/Neurexinもまた，シナプス形成と機能のためのアストロサイト–ニューロン相互作用のメディエーターとして知られている．ここで我々は，小脳における神経細胞接着分子DSCAMとアストロサイトGLASTのヘテロフィリック結合，およびGLASTのシナプス周囲局在の制御機構を明らかにした^14）．平行線維シナプスにおけるこのDSCAM-GLAST相互作用は，平行線維シナプスの形成と機能に必要なだけでなく，登上線維シナプスの形成にも重要であった．三者間シナプスにおける膜貫通タンパク質の多様性を考慮すると，本研究は，アストロサイトとニューロンの相互作用が，局所的なシナプス形成に重要であるだけでなく，プルキンエ細胞などの細胞全体の形態形成と回路網に影響するという興味深い可能性を示唆している．

現在までに，DSCAM分子は統合失調症や自閉症などの精神神経疾患に関与していることが知られている^{4, 5）}．このような障害に関与する分子の多くは，シナプス形成と伝達に関与していることが報告されている．その中でもグルタミン酸の除去障害は，シナプス形成異常，過剰入力による神経細胞死，マウスの行動異常などを引き起こすことが知られている^15）．グルタミン酸トランスポーターの遺伝子変異は，ヒトの精神疾患のゲノムワイド配列決定でも報告されている^16）．これらの結果は，DSCAMとGLASTの相互作用が精神神経疾患に関与していることを示唆している．多様な相互作用分子を介して，DSCAMが脳領域全体でどのように機能するかを明らかにすることは，脳精神疾患の解明と治療に貢献すると期待される．