生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

ゲノムDNAは内的・外的要因によって絶えず損傷を受けており，これらを修復するため生物はさまざまなDNA損傷修復経路を備えている．ヌクレオチド除去修復（nucleotide excision repair：NER）は，紫外線によって誘発されるシクロブタン型ピリミジン二量体（cyclobutane pyrimidine dimer：CPD），ピリミジン-ピリミドン（6-4）光産物（pyrimidine-pyrimidone（6-4）photoproduct：6-4PP），化学変異原によるDNA塩基付加体など，主に環境因子に由来するさまざまなDNA損傷を除去する修復経路である．NERの遺伝的欠損は，ヒトにおいて皮膚がんの高発を特徴とする色素性乾皮症や早老症の一種であるコケイン症候群などの潜性遺伝性疾患を引き起こすことから，きわめて重要な生体防御機構であることが古くから知られている．

他方で真核生物の長大なゲノムDNAは，147塩基対のDNAがヒストン八量体に巻きついたヌクレオソーム構造を基本構成単位とした，クロマチン構造を形成して細胞核内に収納されている．一般的に，クロマチン構造は転写，複製，組換え，修復といったゲノムDNAの機能を抑制すると考えられており，適切な機能発現のためにはDNAやヒストンの化学修飾，クロマチンリモデリング因子などを介したクロマチンの動的な構造変換が必要である．ヒストン修飾と遺伝子発現制御の関与は深く理解されている一方で，DNA損傷を修復する際のクロマチンダイナミクスが，転写と同様の原理によって制御されているかどうかは明らかではない．本稿では，まず哺乳類NERにおける損傷認識の分子機構について概説した後，ヒストン修飾が損傷認識を補助するメカニズムについて我々の最近の知見を中心に紹介し，生体内におけるNERの高次制御機構に関して議論をしたい^1）．

NERは大別すると損傷の認識，DNA二重鎖の巻き戻し，損傷を含む短鎖DNAの切り出し，DNA修復合成という4段階の反応から構成される．このうち損傷認識のステップには，転写と共役した修復とゲノム全体の修復（global genome NER：GG-NER）という，二つの副経路が存在する．転写と共役した修復は，転写伸長中のRNAポリメラーゼIIが鋳型DNA鎖上の損傷によって進行を阻害されることで修復が開始される．一方，哺乳類のGG-NERでは，XPC複合体（XPC-RAD23-CETN2ヘテロ三量体）およびUV-DDB（DDB1-DDB2ヘテロ二量体）という，二つのDNA結合タンパク質因子が損傷認識に関与していることが知られる^2）．XPCは6-4PPやかさ高い塩基付加体など，DNA二重鎖に比較的大きな歪みを生じさせるさまざまな損傷の存在を認識し，基本転写因子TFIIHを呼び込むことで修復反応を開始させる．このような幅広い基質特異性は，XPCが損傷そのものではなく，損傷周囲の塩基対が不安定化した結果として生じる非対合塩基を認識するという生化学的性質に依拠している（図1A）^{3, 4）}．一方，UV-DDBは紫外線によって誘発される6-4PP, CPDに対して直接結合し，XPCの損傷部位へのリクルートを促進すると考えられている（図1B）^5）．特にCPDは，DNA二重鎖に生じる構造的歪みが比較的軽微であり，XPC単独では認識が困難なため，この種の損傷の修復はUV-DDBへの依存度が高いことが知られている^6）．

図1 哺乳類GG-NERのDNA損傷認識機構

（A）CPDを含む二本鎖DNAと結合したRad4-Rad23複合体（出芽酵母におけるXPC-RAD23のホモログ）の結晶構造^3）（PDB ID：2QSG）．（B）6-4PPを含む二本鎖DNAと結合したUV-DDBの結晶構造^4）（PDB ID：3EI1）．（C）UV-DDBはヌクレオソーム上に発生した紫外線誘発損傷に結合できるのに対して，XPCによる損傷部位への結合はヌクレオソーム構造によって阻害される．UV-DDBは損傷を認識した後，クロマチン構造変換因子のリクルートなどを介して，XPCの損傷認識を補助すると考えられる．一方，UV-DDBを介さない6-4PPやDNA塩基付加体の修復においては，異なるメカニズムによって損傷部位のクロマチンが動的に構造変換され，XPCとの相互作用が可能になると考えられる．

それでは，両者はクロマチン構造上に発生した損傷をどのように認識するのだろうか？　UV-DDBはヌクレオソーム上に位置する損傷にも結合可能であることが生化学的・構造生物学的解析によって明らかにされている（図1C）^7）．それに対して，ゲルシフトアッセイや無細胞NER反応系を用いた解析から，損傷部位がヌクレオソーム構造を形成することでXPCによる損傷認識の効率が大きく低下することが示されている^{8, 9）}．したがって，XPCが損傷部位と相互作用する際にはクロマチン構造の変換を伴う可能性が高いと考えられるが，この分子機構に関する統一的なモデルはいまだに確立されていない（図1C）．たとえば，細胞生物学的解析により，UV-DDBは損傷部位にINO80などのクロマチン構造変換因子をリクルートするほか，特定のゲノム領域へのUV-DDBの係留によって損傷非依存的に周辺のクロマチンの脱凝縮を引き起こすことが報告されているものの，これらがXPCの呼び込みにどのように関与するか，詳細なメカニズムの検討はまだなされていない^10）．さらに，6-4PPを含め，NERの基質となる大部分の損傷はUV-DDB非依存的に修復されることから^6），UV-DDBとは独立してXPCの損傷認識を補助するクロマチン構造変換機構が存在すると考えられていたが，その全体像はほとんどわかっていなかった．

我々は以前に，組換えタンパク質を用いた生化学的解析によって，XPCがヒストンH3と直接結合し，この相互作用がヒストンのアセチル化修飾によって減弱することを見いだしていた^11）．さらに興味深いことに，細胞核の局所に紫外線を照射した後，抗ヒストン修飾抗体を用いた免疫蛍光染色を行ったところ，損傷領域においてヒストンの脱アセチル化が観察された．一般的に，ヒストンのアセチル化修飾はクロマチン構造の弛緩や転写活性化因子のリクルートを通して，遺伝子発現を正に制御することが知られているが，以上の結果よりGG-NERの損傷認識過程においてはヒストンアセチル化が負の制御因子として作用する可能性が考えられた．そこで我々は，損傷が発生した領域において積極的に誘導されるヒストンの脱アセチル化が，XPCの損傷認識を補助するという仮説をたて，これを制御するヒストン脱アセチル化酵素（histone deacetylase：HDAC）の同定に挑んだ．まず，多光子吸収によって波長260 nmの紫外線に相当する刺激を細胞核内の任意の領域に与えられる機能を搭載した生細胞イメージングシステムを構築し，XPCが損傷を認識する過程を高い時間分解能で解析するための実験系を確立した（図2A）^12）．この手法とHDAC阻害剤やsiRNAによる発現抑制を組み合わせて解析を行った結果，HDAC2およびその活性化因子であるMTAファミリータンパク質が，損傷部位のヒストン脱アセチル化を引き起こすことでXPCの損傷部位への呼び込みを促進することが見いだされた（図2B）^1）．同様の効果は内在性DDB2を欠損した細胞においてもみられたことから，HDAC2やMTAファミリータンパク質はUV-DDBとは独立した経路で働くことが強く示唆された．この結果を支持するように，HDAC2やMTAファミリータンパク質自身もDNA損傷部位にリクルートされることも観察された．さらに，ラクトース・オペレーター（LacO）配列をゲノム上の特定領域に保有する細胞に対して，ラクトース・リプレッサー（LacR）と融合したHDAC2を発現させ，HDAC2をLacO領域に係留させたところ，LacO領域への損傷非依存的なXPCのリクルートが誘導されたことから，ヒストン脱アセチル化がXPCの核内局在・損傷認識を正に制御する因子であることが強く示唆された（図2C）．

図2 HDAC2はXPCの損傷認識・核内局在を制御する

（A）多光子吸収により細胞核内に紫外線誘発DNA損傷を局所的に誘発することで，EGFPを融合したXPCによる損傷認識過程を生細胞イメージングにより継時的に解析できる．（B）HDAC2の発現抑制によってXPCの損傷部位への呼び込みが減弱する（文献1より改変）．（C）ゲノムDNAの特定部位に256コピーのLacO配列が挿入された細胞に対して，EGFP-XPCとmCherry-LacRを発現させても，LacO領域へのXPCの顕著な呼び込みは観察されない．一方，mCherry-LacRと融合したHDAC2を発現することによって，損傷非依存的なXPCの呼び込みが確認できる．

このように，生体内においてヒストン脱アセチル化酵素がXPCの機能を直接制御しうることが見いだされたが，XPCとヒストンH3の相互作用様式の詳細については不明であった．そこで我々は，マウス由来細胞が特徴的な斑点状のヘテロクロマチン構造を有し，この領域のヒストンが低アセチル化状態に維持されていることに着目した．実際，EGFPを融合したXPCをマウス胎仔線維芽細胞に発現させたところ，XPCとヘテロクロマチンの共局在が観察されたため，このユニークな局在を指標としてXPCのヒストン結合に必要な機能領域を探索した．その結果，XPCタンパク質の中央部分に位置する天然変性領域（以下，「M領域」という）がヘテロクロマチンへの局在に必要十分であることが見いだされた．さらに，M領域を欠失したXPC変異体（XPC-ΔM）組換えタンパク質を調製して生化学的解析を実施したところ，野生型XPCと比較して裸の損傷DNA基質を用いた無細胞NER反応には影響がない一方で，ヒストンH3テールとの相互作用が減弱することが示された．そして，M領域のみでヒストンH3テールとの直接結合に十分であり，アセチル化修飾によってこの相互作用が減弱したことから，ヒストンH3テールとの相互作用を制御する機能領域としてのM領域の重要性が強く示唆された．

M領域が生体内における効率的な損傷認識に寄与するか解析するため，内在性DDB2およびXPCを同時に欠損した細胞を親株として，野生型XPCとXPC-ΔM変異体をそれぞれ安定的に発現させ，NER欠損に対する機能的相補性を比較した．その結果，XPC-ΔMは野生型XPCと比べて損傷部位へのリクルートが減弱し，また紫外線照射後の6-4PPの修復速度が低下したことから，M領域が生体内における損傷認識に重要な機能を持つことが明らかとなった．さらに，野生型XPCとは異なり，HDAC2を発現抑制してもXPC-ΔMの損傷部位へのリクルートはそれ以上低下しなかったことから，HDAC2複合体はヒストン脱アセチル化を介してM領域とH3テールの相互作用を増大させることで効率的な損傷認識を補助するというモデルが支持された（図3）．M領域のアミノ酸配列の保存性は生物種間で比較的低く，特に出芽酵母のXPCホモログであるRad4にはM領域自体が存在していないため，XPCのヒストン結合能およびこれを介した損傷認識補助機構は，真核生物の進化の過程において獲得された新機能であると考えられる．一方，出芽酵母Rad4の損傷認識補助因子であるRad7は，ヘテロクロマチン形成因子Sir3と相互作用することが報告されており，GG-NERと転写抑制性クロマチン関連因子の機能連関という観点でみると，進化的保存性が示唆される点は興味深い^13）．

図3 ヒストン脱アセチル化修飾を介したXPCの損傷認識補助

ヒストンがアセチル化されたゲノム領域にDNA損傷が発生すると，HDAC2複合体によってヒストン脱アセチル化が誘導される．これによってヒストンH3テールとXPC-M領域の相互作用が増強され，損傷部位近傍におけるXPC分子の密度が増大する．この後，ヒストン八量体の移動または除去によってクロマチン構造が動的に変換されることで，最終的にXPCが損傷部位と相互作用することが可能になると考えている．

今回我々は，生細胞イメージングや組換えタンパク質を用いた生化学的解析を組み合わせ，ヒストン脱アセチル化がXPCの損傷認識を直接補助するという，転写制御とは異なる原理で働くDNA損傷認識補助機構の一端を明らかにすることに成功した．一方，最終的にXPCが損傷を認識するためには，損傷部位のヒストン八量体自体を移動または除去する必要があると考えられ，このステップがどのような因子によって制御されているかは現時点では解明できていない（図3）．この過程にはATP依存性クロマチン構造変換因子などが関与すると予想されるが，今後は網羅的な逆遺伝学的解析や損傷を含むクロマチン基質を用いた生化学的解析を組み合わせることで，生体内におけるXPCの損傷認識の素過程の解明につながると期待される．さらに，本研究では局所紫外線照射部位においてヒストン脱アセチル化が誘導されることを示したものの，これは損傷部位における特定のヒストン修飾の変化という一面を捉えたにすぎず，「損傷部位においてクロマチン構造はどのような変化をするか」という根本的問いについて，その全体像はいまだ不明な点が多いことにも留意する必要がある．たとえば，全反射顕微鏡を用いたヒストンの一分子解析によって，紫外線照射した細胞においてはヌクレオソーム自体の易動度が上昇することが報告されており，損傷部位におけるヒストン脱アセチル化によって誘導されるクロマチン構造の変化は，単純なヘテロクロマチン化とは異質なものであることが示唆される^14）．さらに近年の技術発展によって，クライオ電子線トモグラフィーにより細胞内の高次構造を非常に高い分解能で観察する手法が確立されつつあり，これを用いて核膜近傍の高次構造観察に挑戦した研究も実施されている^15）．従来の固定したサンプルを用いた蛍光顕微鏡観察のみでなく，今後は経時的変化の解析や空間分解能に優れた新規のイメージング技術を応用することによって，DNA損傷部位におけるクロマチンダイナミクスをより深く理解することが期待される．