生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

上皮細胞には異常な細胞を認識・排除するという細胞防御システムが備わっている．異なる状態の細胞が隣り合っている場合に，環境への適応度が高い正常な細胞が適応度のより低い細胞を敗者細胞として排除する「細胞競合」という現象が1975年にショウジョウバエにおいて発見された^1）．これは魚類や哺乳類においても保存されており，哺乳類では一つの原がん遺伝子，またはがん抑制遺伝子に変異を持つがん変異細胞が敗者細胞として排除される^2）．興味深いことに，敗者細胞となる異常細胞のみが存在する場合にはこの排除は起きないことから，正常細胞と異常細胞の相互作用が上皮細胞の排除能に寄与する可能性が示唆されていた．近年，我々のグループを含めたいくつかの研究グループによって，正常-がん変異細胞間における細胞間相互作用として，形質膜タンパク質を介した直接的あるいは分泌因子などによる間接的な相互作用機構が解明されつつある．本稿では，上皮細胞による異常細胞に対する認識機構に着目して，上皮細胞の細胞防御機構について概説する．

上皮細胞層中に生じたがん変異細胞は細胞膜の張力が亢進し，それを正常細胞は物理的性質変化として感知する．我々は，形質膜タンパク質AltR（suboptimal alteration recognizing protein）を新たに同定し，AltRを介して上皮細胞が異常を感知・がん変異細胞を認識し，がん変異細胞に対する排除能を惹起することを見いだした^3）（図1a）．AltRはイヌ腎臓上皮由来のMDCK細胞に発現しているがこれまで機能未知であり，我々はがん変異細胞の物理的性質変化に応答する分子として絞り込んだ．正常細胞とがん変異細胞の共培養時におけるAltRタンパク質の挙動を解析したところ，変異型Rasを発現導入したがん変異細胞（Ras変異細胞）と隣接した正常細胞においてAltRの発現が誘導された．加えて，正常細胞とRas変異細胞を共培養するin vitro細胞競合モデルにおいて，AltRまたはヒトで最も相同性の高い白血球免疫グロブリン様受容体B3（leukocyte immunoglobulin-like receptor B3：LILRB3）を正常細胞で遺伝子欠損させると，Ras変異細胞の排除が抑制された．以上の結果から，正常細胞においてRas変異細胞の物理的性質変化に応じて発現誘導されたAltR/LILRB3が，変異細胞の排除に必要であることが示唆された．

図1 正常上皮細胞による隣接がん変異細胞の認識と上皮層からの排除

（a）哺乳類における細胞競合現象の概要図．上皮細胞層中に生じた変異細胞は，隣接する正常上皮細胞に認識される．認識された変異細胞は正常細胞による押し出しの力によって，頂端部から体外へ排出される．（b）正常細胞のAltRが変異細胞のMHC-Iと相互作用することで排除機構が惹起され，変異細胞は頂端側（体外方向）へ押し出される．RUNX2を介して共培養特異的に発現誘導されたAltRは，変異細胞のMHC-Iと結合すると，リン酸化されてSHP2と結合する．結合したSHP2は，ROCK2を活性化する．その下流のFilaminが集積することで，正常細胞が変異細胞を排除する力を生み出す．

次に，正常細胞のAltRと相互作用するRas変異細胞側のカウンターパートとして，AltRの細胞外にある免疫グロブリン様ドメインに結合しうる主要組織適合性遺伝子複合体クラスI（major histocompatibility complex class I：MHC-I）に着目した．MHC-Iは多くのがん細胞で発現抑制されているが，正常細胞にRasV12タンパク質を発現させると発現亢進する^4）．加えて，in vitro細胞競合モデルにおいてRas変異細胞でMHC-Iを遺伝子欠損させると変異細胞の排除が抑制された．したがって，RasV12依存的に発現促進されるMHC-Iが変異細胞の排除に必要であることが示唆された．

続いて，正常細胞のAltRとRas変異細胞のMHC-Iが実際に細胞間で相互作用するかを解析した結果，両タンパク質は正常細胞とRas変異細胞の境界面に集積し，一部では共局在した．加えて，共免疫沈降実験の結果から，AltRの細胞外D1/2ドメインのリコンビナントタンパク質（rec.D1/2）とMHC-Iの細胞外α3ドメインのリコンビナントタンパク質（rec.α3）が直接結合した．さらに，in vitro細胞競合モデルにおいて，rec.α3処理は変異細胞の排除を促進した一方で，rec.D1/2処理は排除を抑制した（図2a）．加えて，正常細胞におけるLILRB3の遺伝子欠損は，rec.α3処理の有無にかかわらず，変異細胞の排除を抑制した．以上の結果から，変異細胞のMHC-Iが正常細胞のAltR/LILRB3に認識されることで，変異細胞が排除されることが示唆された（図1b）．

図2 AltR–MHC-Iの相互作用を介した変異細胞の排除機構

（a）MHC-I α3のリコンビナントタンパク質（rec.α3）は変異細胞の排除を促進した一方で，AltR D1/2のリコンビナントタンパク質（rec.D1/2）は排除を抑制した．コラーゲンゲル上に，50：1の割合で混合した正常細胞と変異細胞を播種し，単層形成後に培地へdoxycyclineと，rec.α3またはrec.D1/2を同時に添加した．16時間後に細胞を固定・染色し，変異細胞の排除効率を算出した．（b）rec.α3は正常細胞のLILRB3を介して腫瘍形成を抑制した．10：1の割合で混合したHaCaT細胞とRasV12細胞を，PBSまたはrec.α3とともにヌードマウスに皮下投与した．doxycycline投与によってRasV12を発現誘導してから，14日後に腫瘍を回収した．腫瘍は1 cm×1 cmの枠内に置いて撮影した．（c）rec.α3は悪性結節の形成を抑制した一方で，rec.D1/2は結節形成を促進した．GST, rec.α3，または，rec.D1/2を経鼻投与したマウスに，ウレタンを投与して肺で発がんを誘導した．7週間後に肺を回収し，前がん病変である悪性結節の数を測定した．図の矢頭ががん結節を示す．肺全体における悪性結節の総数を下のグラフに示す．データは平均値±標準偏差である．GST：n＝11, rec.α3：n＝8, rec.D1/2：n＝7．**p＜0.01, ****p＜0.0001（スチューデントのt検定の両側検定）．

次に，MHC-Iとの相互作用によって正常細胞のAltR/LILRB3が応答しているかを調べるために，正常細胞内のAltR下流シグナルを探索した．はじめに，AltRの活性化を調べたところ，細胞内のITIM（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）ドメインは共培養特異的にリン酸化が亢進した一方で，変異細胞のMHC-Iを遺伝子欠損するとAltRのリン酸化の亢進は抑制された．加えて，リン酸化ITIMドメインに結合するSHP2（Src homology region 2-containing protein）は，rec.α3刺激によって正常細胞のLILRB3との結合が増強した．また，正常細胞においてSHP2を過剰発現させると，Ras変異細胞との境界面におけるアクチン骨格形成因子Filaminの集積とRas変異細胞の排除が促進された．一方で，ROCK2の阻害はSHP2の過剰発現によって促進されたFilamin集積とRas変異細胞の排除を抑制した．以上の結果から，Ras変異細胞のMHC-Iによって刺激された正常細胞のAltR/LILRB3はSHP2–ROCK2経路を介してFilaminを集積させることで，Ras変異細胞を排除することが示唆された（図1b）．

最後に，AltR-MHC-Iを介した変異細胞の排除機構が腫瘍形成や発がんを抑制できるかを検証した．まず正常細胞とRas変異細胞を移植する造腫瘍アッセイを用いて，腫瘍形成に対するrec.α3の影響を評価した．ヌードマウスへ細胞を移植すると腫瘍が形成されるが，rec.α3を細胞と共投与すると腫瘍形成は抑制された．一方で，受容体であるLILRB3を正常細胞で遺伝子欠損すると，rec.α3による腫瘍形成の抑制効果は阻害された（図2b）．よって，rec.α3は正常細胞のLILRB3を介して腫瘍形成を抑制することが示唆された．

さらに，より生理的な発がんモデルであるウレタン誘導性の化学発がんマウスモデルを用いて，MHC-IとAltRの発がんに対する影響を評価した．マウスにウレタンを投与すると，肺の上皮細胞にRas変異が生じることが知られる^5）．その結果，投与後2か月で前がん病変である悪性結節が形成され，最終的に4か月程度で悪性腫瘍になる^6）．ウレタン処理マウスに変異細胞の排除を促進するrec.α3を投与すると悪性結節の形成が抑制された一方で，変異細胞の排除を抑制するrec.D1/2投与マウスでは結節形成が促進された（図2c）．さらに，AltRのマウスオルソログ遺伝子である免疫グロブリン様受容体B（paired immuno-globulin-like receptor B：PirB）を肺の上皮細胞で発現抑制すると，rec.α3による悪性結節の形成抑制効果が阻害された．したがって，MHC-IとAltR/LILRB3の相互作用を介して変異細胞が排除された結果，腫瘍形成や発がんが抑制される可能性が示唆された．

AltR-MHC-Iの相互作用を介した正常細胞の攻撃能を高める機構がある一方で，受容体型チロシンキナーゼエフリン受容体A2（erythropoietin producing hepatoma receptor-A2：EphA2）はがん変異細胞の動態を制御する^7）（図3a）．Ras変異細胞ではMEK（meiosis-specific serine/threonine-protein kinase）–ERK（extracellular signal-regulated kinase）経路を介してEphA2が発現誘導される．そして，正常細胞–Ras変異細胞がE-Cadherinを介して細胞間接着すると，正常細胞側のephrinAがRas変異細胞のEphA2を刺激する．その結果，EphA2はSrcの活性化を介してMyosinIIの集積を促進させることで，Ras変異細胞の収縮と正常細胞との細胞反発を誘導し，上皮層からRas変異細胞が逸脱する．このように正常細胞–変異細胞間におけるタンパク質リガンド–受容体相互作用により，それぞれのがん変異細胞は上皮細胞層から排除される．

図3 その他の相互作用を介した変異細胞の排除機構

（a）EphA2–ephrinAの相互作用によって変異細胞は排除される．変異細胞でRasV12が発現すると，MEK–ERK経路を介してEphA2の発現が誘導される．そして正常細胞がE-Cadherinを介して変異細胞に接触すると，正常細胞のephrinAがRasV12細胞のEphA2を活性化する．この活性化により，RasV12細胞内でSrcが働き，MyosinIIの集積が促進され，RasV12細胞が収縮する．その結果，がん変異細胞は正常細胞との反発が起こり，上皮細胞層から排除される．（b）がん変異細胞が分泌するFGF21は，正常細胞の排除能を促進する．Scribble欠損細胞では，ASK1–p38経路を介してFGF21が分泌され，正常細胞のFGFR1に作用する．その結果，正常細胞がScribble欠損細胞に向かって移動し，細胞が密集（コンパクション）することで，細胞死が引き起こされる．（c）がん変異細胞から分泌されたATPは正常細胞の排除能を促進する．がん変異細胞から分泌されたATPは，正常細胞に作用し，NOX2を介して活性酸素種（ROS）を産生させる．その結果，変異細胞のミトコンドリア活性がPDK4によって低下すると，変異細胞は排除される．

また，上皮細胞は分泌因子という間接的な手法も用いて，がん変異細胞を感知し排除する．たとえば，上皮極性因子Scribbleを欠損したがん変異細胞（Scribble欠損細胞）から分泌されたFGF21（fibroblast growth factor 21）^8）やRas変異細胞から分泌されたアデノシン5′-三リン酸（adenosine 5′-triphosphate：ATP）^9）は，正常細胞の排除能を促進することが報告されている．Scribble欠損細胞では，apoptosis signal-regulating kinase 1（ASK1）–p38経路を介して分泌されたFGF21が，正常細胞のFGFR1（fibroblast growth factor receptor 1）に作用する．その結果，正常細胞がScribble欠損細胞へと誘引されると，Scribble欠損細胞を物理的に圧迫することで細胞死が誘導される（図3b）．加えて，ROCK-p38–p53経路がScribble欠損細胞の細胞死を誘導すると報告されている^10）．

また一方で，RasV12細胞などのがん変異細胞から分泌されたATPを受容した正常細胞では，NOX2（NADPH oxidase 2）を介して細胞内活性酸素種（reactive oxygen species：ROS）が産生される．その結果，変異細胞においてPDK4（pyruvate dehydrogenase kinase 4）を介してミトコンドリア活性が低下すると，変異細胞は排除される（図3c）．このように，上皮細胞は異常細胞からの分泌因子を認識することで，異常細胞に対する排除機構を惹起する．さらに加えて，正常細胞はS1PR2（sphingosine 1-phosphate receptor 2）により細胞外のS1P（sphingosine1-phosphate）を認識することで，Rho/ROCK–Filamin路を介してRas変異細胞を排除する^11）．この細胞外S1Pの分泌源は明らかになっていないが，S1P–S1PR2の相互作用はほかのがん変異細胞–正常細胞の相互作用でがん変異細胞を排除する可能性が示唆されている．

上皮細胞は免疫細胞ではないにもかかわらず，自身の発現する形質膜受容体AltRを介して，隣接する異常な細胞のMHC-Iを認識し，攻撃・排除する．EphA2–ephrinAの相互作用は変異細胞の収縮などの動態を制御するという正常細胞→がん変異細胞のシグナルであるのに対し，MHC-I-AltRの相互作用は正常細胞の攻撃能を惹起するというがん変異細胞→正常細胞のシグナルである．さらに，リガンドであるMHC-Iのリコンビナントタンパク質投与は，in vitroにおいて上皮細胞の攻撃能を亢進させるだけでなく，in vivoにおいて発がんや腫瘍形成を抑制した．これらのことから，上皮細胞によるがん変異細胞に対する認識・攻撃能は，新たながん治療法の分子基盤となると期待される．加えて，がん治療の現状として腫瘍発見時にすでに浸潤・転移しているために難治性となるため，より早期の発見・治療が求められている．この問題に対して，上皮細胞による細胞防御機構は，発がんよりも前段階の前がん状態であるがん変異細胞を排除することで，予防的診断・治療法へ応用できる可能性を秘めている．