生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

海洋は地球表面の約7割の面積を占める「広い」環境であると同時に，平均で水深3700 m，最大で約11,000 mにも到達する「深い」環境である．この深さ方向の広がりは，海洋の物質循環や生態系を考える上で重要である．たとえば，外洋では沿岸域よりもはるかに海水の透明度が高いが，それでも太陽光は水深200 m程度までしか到達しない．そのため，光合成による有機物合成は，海洋表層のみで行われている．一方で，200 m以深の深海と呼ばれる海洋帯は，暗黒・低温・高圧が支配する極限環境であり，熱水噴出域といった一部の例外的なスポットを除いて，生物活動による一次生産量は表層に比べて圧倒的に少ない．海洋表層で生産された有機物は，デトリタス（生物の排泄物や死骸など）の形で海洋表層から深層へと沈降する．この沈降物質の一部は，深海観測では雪が降るようにみえることから，マリンスノーと呼ばれることで有名である．このような海洋表層から深海への有機物の流れは生物ポンプ（biological pump）と呼ばれ，深海環境の生物へエネルギー源を供給し，その独特な生態系を形作る基盤となっている．

この沈降過程では，有機物は深海中の生物の餌となり，デトリタスとなって再度沈降する，というサイクルを繰り返し，最終的に海底に堆積する．この過程では，生物が利用しやすい形態の有機物は速やかに消費される一方で，いわゆる難分解性の有機物は分解を受けにくい，というバイアスがかかると考えられている．そのため深海堆積物は，そこに至るまでに分解を受けなかった難分解性のものが濃縮された，生物的に貧栄養な環境である．そして，その有機物の質・量にかかる非常に厳しい制約のため，深海堆積物では陸上や海洋表層とはまったく異なるユニークな微生物生態系が構築されている^1）．一方で，深海域の面積は海洋の表面積の8割（すなわち，地球表面積の約6割）をカバーする広大な環境であり，深海堆積物中の微生物のバイオマスは膨大で系統分類学的な多様性も高いと見積もられている^2）．そのため，地球規模での物質循環や極限環境の微生物生態・代謝系の解明，さらには新規性の高い微生物系統や酵素探索など，さまざまな微生物研究を展開する上で，深海は非常に興味深い環境である．しかしながら，現代のマリンテクノロジーを駆使してなお，深海は人類のアクセスが困難な環境であり，研究の大きな制約となっている．

深海を含めて，地球環境中に生息する微生物は，その大半が実験室で培養されていない，いわゆる未培養系統群に属する微生物である．分離培養に頼らずに，このような環境微生物が持つ酵素を網羅的に探索する上で，メタゲノム解析は効果的である^3）．この手法では，試料中の微生物叢DNAを丸ごと抽出してシーケンスし，ゲノム配列を系統網羅的に取得する．そして，得られた配列データを対象に各種のバイオインフォマティクス解析を施すことで，さまざまなゲノム・遺伝子レベルの解析が実施可能である．近年，メタゲノムから任意の酵素遺伝子をin silicoに探索する研究が世界的に進められており，動物園や水族館でおなじみの齧歯類であるカピバラの腸内微生物叢メタゲノムから，新規糖質分解酵素ファミリーを樹立した研究などが報告されている^4）．メタゲノムから新規・未知酵素群を探索する研究は近年脚光を浴びつつあるが，現状の報告例は決して多くない．ましてや，数ある環境の中でも深海環境をターゲットとした酵素探索研究例は限られており，今もなお膨大な未知の酵素群が海底に眠っていることが期待される．

そこで，我々の研究グループでは，糖加水分解酵素であるβ-N-アセチルガラクトサミニダーゼ（β-NGA）が含まれる糖質分解酵素ファミリー123（glycoside hydrolase family 123：GH123）に着目し^5），深海堆積物のメタゲノム情報を活用して新規酵素の探索を行った．その結果，既報の酵素と基質特異性が異なり，系統的にも離れている多数の新規β-NGA酵素群を発見し，GH123に五つのサブファミリー分類を提案した研究を展開してきた^6）．本稿では，この研究成果について概説する．

β-N-アセチルガラクトサミン（β-GalNAc）は，多糖，糖タンパク質，糖脂質などの複合糖質に含まれており，バクテリア（細菌）・アーキア（古細菌）・真核生物において，細胞間認識や接着・感染などの相互作用，情報伝達，免疫応答などのさまざまな生物学的プロセスに重要な役割を果たしている．β-GalNAc含有糖鎖の機能調節に関わる糖質分解酵素には2種類報告があり，一つがβ-GalNAcを厳密に認識し作用するβ-NGA^5），もう一つがβ-GalNAcとβ-N-アセチルグルコサミンの両方に作用するβ-ヘキソサミニダーゼ（β-HEX）である^7）．β-HEXはバクテリア・アーキア・真核生物の全ドメインをまたぐ100以上の遺伝子について機能解析されており，糖質関連酵素をアミノ酸配列に基づき分類しているCAZy（Carbohydrate-Active enZymes）データベース^8）において，主にGH20（一部はGH18, GH84など）に分類されている．一方でβ-NGAは土壌やヒト腸内細菌由来の3種の酵素しか報告例がなく，それらはすべてGH123に分類されている．また，β-NGAの基質特異性に関しても，β-GalNAc含有糖鎖の非還元末端の単糖のみに作用する厳密なエキソ型（単糖遊離型）β-NGAの報告例しかなく，糖鎖の内部に作用するオリゴ糖遊離型β-NGAは未報告である．しかし，β-GalNAcは自然界に普遍的に存在する糖であり，陸上環境のみならず海洋環境においても，たとえば微生物の細胞外多糖や，魚介類の不可食部に多く含まれるコンドロイチン硫酸に含まれていることが知られている．β-GalNAc含有糖鎖の多様性や存在量，それらの糖鎖が関与する生命現象の重要性を鑑みると，自然界には未発見のβ-NGAが多数存在すると考えられる．そこで我々は，自然界におけるβ-GalNAcを介した生命現象の包括的理解に向けて，深海微生物叢のメタゲノム情報を用いた新規β-NGAの探索を試みた．

本研究では，海洋微生物叢サンプルとして，伊豆・小笠原海溝（東京都小笠原諸島父島より北東約300 km，水深5747 mの地点）から，深海調査研究船「かいれい」と大深度小型無人探査機「ABISMO」を用いて採取された海底堆積物コアを利用した．深海堆積物は，海域や水深，海底地形，堆積物深度などに応じて，酸素や硝酸等の溶存化学成分や細胞密度，菌叢構造がダイナミックに変化する^1）．そこで本研究では，多様な菌叢試料の解析を目的に，4画分（堆積物深度0～8, 13～23, 53～63, 113～123 cm）の試料を用いた．深海堆積物に最適化されたプロトコルによるDNA抽出と精製を行い^9），Illumina MiSeq/HiSeqを利用したショットガンシーケンシングからメタゲノム配列データを得た．このデータを用いて，metaSPAdesを用いたメタゲノムアセンブリとProdigalを用いた遺伝子予測を行い，スタートコドンからストップコドンまでの全長を予測できた完全長遺伝子配列セットを取得した．これを利用して，CAZy分類に基づいた配列検索用データベースであるdbCANを利用した機能アノテーションを行い，サンプル中の微生物叢が持つ糖質関連酵素を網羅的に探索した．その結果，β-NGA候補を3配列（dssm_1, dssm_2, dssm_3）得たが，これらの配列は，既報のGH123に属するβ-NGAのアミノ酸配列と比較して，配列全体の類似性はかなり低かった．しかし，既報β-NGAの触媒機構であるsubstrate-assisted catalysisに重要な二つの酸性アミノ酸（酸／塩基触媒残基のグルタミン酸と，基質であるβ-GalNAcの2-アセトアミド基のstabilizerのアスパラギン酸）は保存されていた．AlphaFold2^10）を用いたタンパク質の予測立体構造では，dssm_1はGH123とは大きく異なっていたものの，dssm_2とdssm_3は既報のGH123のβ-NGAと類似した全体構造が予想された（図1A）．そこで，後者の2配列のリコンビナント酵素の作製（DSSM_2, DSSM_3）を試みたところ，DSSM_2は可溶化酵素が得られなかったが，DSSM_3は可溶化酵素の作製に成功した．パラニトロフェニルグリコシド（pNP-glycosides）を基質とした活性測定の結果，DSSM_3は既報のGH123の酵素が示す単糖遊離型の活性を示しただけではなく，糖鎖の内部のβ-GalNAcにも作用するオリゴ糖遊離型の活性も示した（図1B）．これまでオリゴ糖遊離型のβ-NGAは報告例がなく，これが初のオリゴ糖／単糖遊離型β-NGAの発見である．

図1 新規β-NGA候補配列の立体構造と機能およびDUF4091を持つβ-NGA候補配列の系統樹

（A）GH123のβ-NGAのX線結晶構造と深海メタゲノム由来の新規β-NGA候補配列のAlphaFold2を用いた予測立体構造の比較．（B）GH123のβ-NGAと深海メタゲノム由来の新規β-NGAの作用位置の比較．（C）新規β-NGA候補配列の系統樹．深海メタゲノム由来の新規β-NGAの発見の手がかりとなったDUF4091を持つ740配列を用いた分子系統解析の結果，GH123と系統的に離れた四つのグループを発見した．

上述の深海メタゲノム由来の新規β-NGAについて，dbCANを用いた配列検索の結果を精査したところ，具体的にヒットしていた領域は，C末端付近に存在する約70アミノ酸からなる機能未知ドメインDUF4091であった．この領域は，GH123酵素の立体構造では活性部位周辺には位置しておらず，酵素活性に直接的な影響を及ぼさないと考えられたが，その相対的な保存性の高さ（sequence identity＝35％程度）から，新規β-NGAを発見するための手がかりとして活用できると考えられた．そこで，さらなるβ-NGA酵素の発見を目指し，DUF4091に基づく配列データベースの検索を行った．具体的には，タンパク質ファミリーデータベースであるPfamを利用して，DUF4091を含む配列を収集し，既報の酵素を含む740配列を取得した．これらの配列は，バクテリア・アーキア・真核生物のすべてのドメインを含む，さまざまな生物種に由来していた．そして，これらの配列の大半は既報のGH123酵素と配列類似性をほとんど示さず，データベースでは機能未知の遺伝子として登録されていた．分子系統解析では，これらの配列は，既報のGH123が属するグループとは異なる四つのグループに分かれ，それらは既知GH123酵素とアミノ酸配列の類似性が相当に低かった（図1C）．

この全5系統の酵素機能を明らかにするため，それぞれのグループのリコンビナント酵素を作製し，基質特異性を検証した（図2A）．その結果，グループ間で異なる基質特異性を持つことが判明した．グループ1は糖鎖の内部の糖にのみ作用してオリゴ糖を遊離する厳密なオリゴ糖遊離型酵素，グループ2, 3はオリゴ糖も単糖も遊離できるオリゴ糖／単糖遊離型酵素，そしてグループ4と既報のGH123は厳密な単糖遊離型酵素であった．このような機能の違いが何に起因するのかを調べるために，X線結晶構造解析による立体構造解析を行った．その結果，5系統の酵素群の全体構造はとてもよく似ていたものの，それぞれのグループに特徴的な部分構造がみられた（図2B）．具体的には，グループ1は最もシンプルな構造を持っていたのに対し，グループ2, 3, 4とGH123では付加構造や付加ループが存在していた．特に，オリゴ糖遊離型酵素と単糖遊離型酵素との間では，基質結合部位の形状に明確な違いがみられた（図2C）．グループ1, 2, 3のオリゴ糖遊離型酵素は，酵素の表面に溝のようなクレフト構造を持ち，長いオリゴ糖がクレフトに沿って結合することで，糖鎖内部のβ-GalNAcに作用してオリゴ糖が遊離されることが示唆された（図2C左）．一方で，グループ4, 5の単糖遊離型酵素はクレフト構造の片側が付加ループで塞がれており，糖鎖の末端しか入り込めないポケット構造になっているため，末端のβ-GalNAcにしか作用できないことが示唆された（図2C右）．すなわち，オリゴ糖遊離型酵素と単糖遊離型酵素の糖結合部位の違いは，たった10数アミノ酸の挿入により引き起こされていた．

図2 5系統のβ-GalNAcに作用する酵素の構造機能解析から進化の過程をひもとく

（A）5系統のβ-NGAの基質特異性の比較．（B）5系統のβ-NGAの立体構造の特徴．グループ1の構造を基準としてグレーで示し，各グループに特徴的な構造には色をつけて強調した（グループ2はオレンジ，グループ3は薄紫，グループ4は青，GH123はマゼンタ）．（C）オリゴ糖遊離型酵素と単糖遊離型酵素の糖結合部位の構造の比較．（D）5系統のβ-NGAの進化的考察．本研究で見いだした5系統のβ-GalNAcに作用する酵素の進化の過程を，系統樹解析（左）と酵素の構造機能解析（右）から検証した．

上述の5系統の酵素群の構造機能解析から，β-GalNAcに作用する酵素の分子進化の歴史を考察した（図2D左）．5系統の酵素群は，β-GalNAcに作用するという共通の基質特異性を持ち，酵素の進化系統樹解析と立体構造解析から，これらの酵素はホモログであり，始原酵素はグループ1に属し，長い年月の間に蓄積した遺伝子変異により，現在では5系統に分岐したと考えられる．さらに，遺伝子の変異に加えて遺伝子配列の挿入によって，酵素の機能がオリゴ糖遊離型酵素，オリゴ糖／単糖遊離型酵素，単糖遊離型酵素へと多様化した可能性が示唆された（図2D右）．本研究成果を受け，CAZyのGH123に新たにサブファミリー（GH123_1～5）が設立された．

本研究では深海メタゲノム情報を利用した解析から，既報酵素とは基質特異性が異なり，また分子系統的にも遠く離れた新規酵素群を発見した．このことは，陸上とは異なる極限環境である深海のメタゲノム情報が，新規酵素の探索に有用であることを実証した成果である．さらに，公共遺伝子データベースを活用した探索から，これまで未発見だったβ-GalNAcに作用する4系統の新規酵素群の同定と構造機能解析に成功した．この結果は，β-NGAを利用したβ-GalNAc含有糖鎖の生物学的機能を解明し，糖鎖を介した生命現象の知見拡充に貢献するものである．さらに，新規酵素を用いた機能性オリゴ糖の生産や糖鎖構造解析，疾患診断などへの利用の可能性も開けるなど，基礎研究と応用研究の両面で重要な成果となった．

深海の海底面積は，地球表面の約6割を占める広大な環境でありながら，人類にとって宇宙よりも到達が難しい，地球最後のフロンティアである．100年を超える海洋研究の蓄積があってなお，その微生物生態の大半は未解明であり，シーケンスに基づくゲノム解析研究も始まったばかりである．一方で，深海を含む自然環境中の微生物の大半は未培養系統であり，それらが持つ酵素群を対象とした，バイオインフォマティクスを活用した網羅的探索の事例は少ない．今後，深海メタゲノム解析と配列情報ベースの酵素探索の両方を推進することで，さらなる多様な新規酵素の発見につながることに疑いの余地はない．そして，得られた新規酵素の機能解明と産業分野への応用を通じて，深海という未開拓バイオマスの有効利用へとつながる研究展開が期待される．