生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

我々ヒトをはじめとする有性生物の多くは卵母細胞（もしくは卵子）がただ一つの精子と受精することにより誕生する．この際，複数の精子と受精（多精子受精，以下，多精）してしまうと，雄由来のゲノムDNAを過剰に持つこととなり，正しく発生することができない．そのため，卵側には一つ目の精子と受精したのちに，他の精子が受精するのを防ぐ多精拒否機構が存在することが知られている．この仕組みについては，古くからウニのように未受精卵を産卵し体外で受精する棘皮生物等を用いて研究が行われ，多精拒否には受精直後に起こる早期ブロックと数十分かけて起こる遅いブロックがあることが示唆されてきた．このうち後者に関しては，表層顆粒の分泌を介した透明帯の化学組成変化を伴う分子機構が知られているが，受精直後に起こる早期の多精拒否機構の存在やその仕組みについてはほとんど不明であった．本稿では，受精前後における卵細胞内の生命現象を生きたまま解析することができる線虫Caenorhabditis elegans（C. elegans）を用いて明らかとなってきた体内受精する生物における多精拒否機構について概説する．

卵はどのようにしてただ一つの精子とのみ受精し，その他の精子を拒否するのか？　この生命誕生における最も基本的な現象には，いまだ多くの謎が残されている^1）．我々哺乳類や線虫C. elegans等では，卵は多数の精子の中から一つの精子とのみ受精し，発生を開始する（単精受精）．一方，鳥類，爬虫類，イモリ等では卵が複数の精子と受精し発生する（多精受精）ケースも知られている．このように種によって受精のプロセスは多様であるが，雌性核と雄性核がそれぞれ一つずつ接合することが必須である．このうち単精受精を保証するメカニズムとして多精拒否の仕組みが存在することが知られている．一般的な教科書には，この過程において以下の二つのプロセスが働くことが記載されている．一つ目は，受精後，数秒以内に卵細胞膜が脱分極することにより生じる膜ブロックである．二つ目は，受精後，数十分かけて表層顆粒の内容物が分泌され，その結果，透明帯の質的変化が生じることにより生じる透明帯（卵殻）ブロックである．これらはそれぞれ早期（fast）ブロック，遅い（slow）ブロックとも呼ばれる．このような知見は，1920年代にErnest Justらによる棘皮生物を用いた研究等に基づいており，その後，体外受精をするほかの水生種にもこれらの多精拒否機構が存在することが示唆されている^2）．しかしながら，近年，卵膜電位の急速な脱分極により生じる多精拒否がアーチファクトではないかとの指摘も報告されてきている^3）．また，これらの生物で観察される卵膜電位の過度な脱分極はマウスなど哺乳類の受精卵ではほとんど観察されないことが報告されている^4）．一方で，ヒトやマウス等では自然交配による受精卵の囲卵腔（透明帯と卵細胞膜の間の空間）において1～2個，最大10個の余剰精子が見つかることから，透明帯ブロックに加え，卵細胞膜による非電気的な多精拒否機構の存在が示唆されている．哺乳類ではマウスを用いた研究が先行している^2）．まず透明帯ブロックに関しては，受精後に表層顆粒を介して分泌されるオバスタシン等により透明帯構成因子ZP2等が部分分解され，その結果，透明帯の質的変化が生じ，持続的な多精拒否に働くことが知られている^5）．一方，膜ブロックに関しては，卵母細胞側では精子を受容するのに働くJunoタンパク質が卵表面から消失する現象との関連，精子側ではPLCζが膜ブロックを惹起する可能性が示唆されているが，詳細なメカニズムについてはさらなる検証が必要である^{6, 7）}．

線虫C. elegansにおいても卵母細胞は一つの精子とのみ受精することから，多精拒否のメカニズムが存在すると考えられる．これまでに，受精後約5分以内に起こるキチン層の形成が多精拒否の仕組みの一つであることが示唆されていたが^8），今回，著者らの研究により線虫にも早期の膜ブロックが存在することが明らかとなってきた．C. elegansは主に雌雄同体として生育し，体内に卵巣と貯精嚢の両者を有する．成虫では，卵巣において生育・成熟した卵母細胞が約300個の精子を含む貯精嚢に向けて排卵され，基本的にただ一つの精子とのみ受精する．その後，子宮へと移動しながら第一，第二減数分裂を完了し，胚発生を開始する（図1A）．卵母細胞が精子と受精し，初期胚へと性質変化していく過程は卵-胚性遷移と呼ばれ，受精後には減数分裂期に働いたタンパク質やRNA等が選択的に分解されつつ，接合子由来の遺伝子産物と置換されることが知られている^9）．著者らは線虫生殖腺におけるライブイメージング系を活用することにより，卵母細胞において働いた一群の細胞膜タンパク質が受精後，エンドサイトーシスされ，リソソームにおいて選択的に分解されることを明らかにしてきた^{10, 11）}．

図1 線虫C. elegansにおける多精拒否の仕組み

（A）C. elegansの雌雄同体の生殖腺における受精過程．C. elegansの雌雄同体の生殖腺では卵母細胞が生育後，第一減数分裂前期で分裂を停止しており，精子からのシグナルを受けると成熟する．その後，貯精嚢へと排卵され，ただ一つの精子と受精し，第一，第二減数分裂を完了する．受精卵は子宮へと送られ，胚発生を開始する．（B）C. elegansにおいては受精後約5分で形成されるキチンによる卵殻形成が多精拒否の仕組みの一つとして知られている．MARC-3欠損卵では，受精後約10秒以内に二つ目の精子との受精が観察されることから，早期の多精拒否機構に異常があると考えられる．

線虫の受精卵では第二減数分裂後期においてエンドソーム上にK（リシン）63型ユビキチンシグナルの集積が観察されることから，このプロセスにユビキチン化機構が関与することが明らかとなってきた．そこで，線虫のユビキチン化関連因子についてRNAiによるノックダウン解析を行ったところ，この過程に働くユビキチン結合酵素（E2酵素）としてUBC-13, UEV-1を同定した^12）．さらに，線虫の卵母細胞膜分解に関与する因子を探索したところ，膜2回貫通型RING-CH型ユビキチンリガーゼ（E3酵素）であるMARC-3を見いだした^13）．MARC-3は哺乳類のMARCH IIIホモログであり，MARCH IIIはエンドソームに局在し，トランスフェリン受容体の輸送に関与することが報告されている^14）．C. elegansのMARC-3は卵母細胞において特に強く発現しており，この遺伝子破壊株においてはさまざまな卵母細胞膜タンパク質の分解が抑制されることが明らかとなった．また，線虫初期胚においては1細胞期にエンドソーム上で顕著なユビキチン化タンパク質の集積がみられるが，MARC-3欠損卵においてはE2酵素であるUBC-13, UEV-1欠損卵と同様にエンドソーム上のユビキチンシグナルの集積が減弱した．これらのことから，MARC-3が受精卵において細胞膜タンパク質分解に働く主要なユビキチンリガーゼの一つであることが判明した^13）．次に，MARC-3に蛍光タンパク質を結合し，受精前後の細胞内動態を解析したところ，MARC-3は卵母細胞においては主に細胞膜とその直下のエンドソーム等に局在し，卵成熟すると細胞内に取り込まれ，受精後，その他の卵母細胞膜タンパク質と同様に分解された．この分解はMARC-3のRING-CHドメインに変異を導入すると阻害されることから，MARC-3は自己ユビキチン化を介して分解される可能性が示唆された．一方，MARC-3と結合するその他のE2酵素を探索した結果，卵-胚性遷移において働くE2酵素LET-70を同定した．このLET-70を欠損すると受精卵における卵母細胞膜タンパク質の分解が阻害されることから，MARC-3は受精前後において異なるE2酵素と連携して母性細胞膜タンパク質の選択的分解に作用するユビキチンリガーゼであることが示唆された．

このmarc-3変異体の表現型についてさらに詳細に解析したところ，欠損変異体では20％程度の受精卵で多精が起こることが判明した（図1B）．線虫では受精後約5分以内に卵の周囲にキチン層が形成され，多精を拒否すると考えられているが^15），marc-3欠損株ではキチン層が形成されているにもかかわらず多精となっていた．また，MARC-3欠損株では複数の精子が同時または約10秒以内に受精するのに対し，キチン層形成に異常を示すegg-3変異株では一つ目の精子との受精から約5分後に二つ目の精子が受精することから，これら変異体では多精が生じるタイミングに明らかな違いが認められた．さらに，egg-3に加えmarc-3も同時に欠損すると多精の頻度がさらに上昇することから，それぞれは別の経路で働くことが示唆された．以上の結果から，MARC-3は体内受精する動物においてこれまで不明であった早期多精拒否機構を制御する新規因子であることが明らかとなった（図1B）．一方，MARC-3のRING-CHドメインに変異を導入すると多精の表現型を示すことから，ユビキチン化を介したメカニズムが多精拒否に関与することが示唆された．意外なことにLET-70を欠損すると低頻度ながら多精の表現型を示すがUBC-13やUEV-1を欠損した卵は多精を示さないことから，MARC-3はまずLET-70とともに多精拒否に働き，その後，LET-70およびUBC-13, UEV-1と連続的に作用することにより母性細胞膜タンパク質の選択的分解を実行している可能性がある．

さらに，キチンによる卵殻形成に働くキチン合成酵素CHS-1やその制御因子であるEGG複合体とMARC-3との関連性について解析を行った．酵母ツーハイブリッド法による解析から，MARC-3のRING-CHドメインを含む細胞質領域とEGG複合体構成因子の一つであるEGG-3が相互作用する可能性が示唆された．この相互作用はRING-CHドメインに変異を導入すると消失する．興味深いことに，EGG-3とE2酵素であるLET-70は両者ともMARC-3のRING-CHドメインを介して結合する．MARC-3は卵成熟の際に細胞内に取り込まれるのに対し，EGG複合体およびCHS-1は受精後まで細胞膜にとどまることから，MARC-3のユビキチンリガーゼ活性は卵生育時までEGG-3により部分的に阻害されており，卵成熟を期にEGG-3からリリースされLET-70と相互作用することによりさらに活性化される可能性もありえる（図2）．このように多精拒否と卵母細胞膜タンパク質分解は生殖プロセスの進行に伴って時空間的に制御されていることが明らかとなってきた．

図2 早期多精拒否と卵母細胞膜の選択的分解におけるMARC-3の機能モデル

線虫の卵母細胞においてRING-CH型ユビキチンリガーゼ（E3酵素）であるMARC-3はユビキチン結合酵素（E2）であるLET-70とともに早期の多精拒否に働くと考えられる．MARC-3はキチン合成酵素CHS-1を制御するEGG複合体のうちのEGG-3とRING-CHドメインを介して相互作用することから，互いに機能相関している可能性がある．受精後はLET-70に加え，別のE2酵素UBC-13, UEV-1とも連携し，リソソームにおける卵母細胞膜タンパク質の選択的分解に働く．MARC-3は卵成熟の段階でエンドソームへと移行し，MARC-3自体も受精後，分解される．文献13, Fig. 8を改訂．

著者らの研究により，これまでほとんど不明であった受精直後に起こる早期の多精拒否機構の一端が明らかとなりつつある．また，MARC-3のRING-CHドメインが多精拒否に重要であることから，ユビキチン化を介したメカニズムが多精拒否に関与すると考えられる．MARC-3欠損卵ではほぼ同時に2個の精子が受精するケースもみられるため，ユビキチン化に要する時間を考慮すると，MARC-3は受精前にはすでに何らかの基質に対するユビキチン化を介して多精拒否の体制を構築している可能性が考えられる．たとえば無秩序な受精を抑制するために，卵母細胞と精子間の接着や膜融合を制御する因子を卵内において適切量，正しい空間的配置に維持するために働いている可能性がある．この場合，MARC-3が欠損すると受精後も受精関連因子が過剰に細胞膜に残存することとなり多精になると考えられる．一方，受精や多精拒否に働く因子の機能調節にユビキチン化が関与する可能性もある．MARC-3とともに働くE2酵素としてLET-70とUBC-13, UEV-1が同定されたが，LET-70の欠損胚のみが多精の表現型を示す．UBC-13, UEV-1はK63鎖型ポリユビキチン鎖の伸長ステップに働くことを考えると，LET-70を介したモノユビキチン化，あるは別のタイプのポリユビキチン化が多精拒否に関与する可能性もある．今後，受精や多精拒否を制御するMARC-3の基質タンパク質の同定が重要となるであろう．一方，MARC-3は哺乳類にも保存されていることから，ホモログであるMARCH-IIIのノックアウトマウス由来の卵を用いることにより，哺乳類における早期の多精拒否機構の理解にもつながると期待される．近年，出産の高齢化に伴い，体外受精により妊娠・出産をするケースが増大している．この際，加齢した卵に対して通常の体外受精を行うと多精になりやすいケースや，自然妊娠における加齢による多精頻度の増加，自然流産との関連性等も報告されている．これらの知見は，加齢に伴い卵の多精拒否の仕組みが弱まっている可能性を示唆しており，今後，哺乳類における多精拒否機構の解析が待たれる．