生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

生物は無機硫酸イオン（SO₄²⁻）をさまざまな有機化合物に付与することで，生命機能を制御している．この硫酸イオンを付与する反応は，「硫酸化」と呼ばれ，硫酸転移酵素（sulfotransferase）によって触媒される酵素反応である．この硫酸化反応を化学的に正確に記すと，スルホン基（–SO₃H）の転移反応であることから，硫酸化（sulfation）のほか，スルホン化（sulfonation）とも表記される．本稿では，これ以降，「スルホン化（sulfonation）」として表記する．硫酸転移酵素はスルホン基の供与体である3′-ホスホアデノシン5′-ホスホ硫酸（3′-phosphoadenosine 5′-phosphosulfate：PAPS）を利用することで，標的分子のヒドロキシ基，または，アミノ基のスルホン化を触媒する化学修飾酵素である（図1A）．硫酸転移酵素は，標的とする基質構造の違いから，タンパク質チロシン硫酸転移酵素と糖鎖硫酸転移酵素，そして，細胞質局在の低分子化合物の代謝に関わる細胞質硫酸転移酵素（cytosolic sulfotransferases：SULTs）の三つに大別される^1）．低分子化合物の代謝を担うSULTsは遺伝子スーパーファミリーを形成しており，ヒトで18種，マウスで21種が報告されているが，基質化合物が見いだされていない酵素も多く存在している^2）．また，SULTsが代謝制御する基質分子は，内分泌ホルモンや環境ホルモン，薬物，ポリフェノールなど，多種にわたる^3）．さらに，スルホン化された基質分子は，スルホン基による負の電荷を有するため，受容体などの分子との相互作用が変化し，生理機能の変化をもたらすと認識されている．反応産物の生理機能を正確に理解するためには，詳細な研究が必要となるが，そのような研究は盛んには行われていないため，スルホン化の生理機能は詳細には理解されていない．

図1 スルホン化反応の概略図とSULT分子種の系統樹

（A）低分子化合物に対するスルホン化反応は無機硫酸イオンと2分子のATPから生合成されるPAPSをスルホン基供与体として利用することで，SULTなどによって触媒される化学修飾反応である．スルホン化された分子は，一般的に，速やかに細胞外にくみ出され，体外へ排泄されると想定される．しかし，近年は，他の組織に輸送され，細胞内外で新たな生理機能を発揮する例が報告されている．（B）マウスSULT遺伝子はSULT1A1からSULT7A1まで多くの分子種が存在し，SULT7A1は最も新たに報告されたSULT酵素である．

我々は，マウスの新規SULTとして，SULT7A1遺伝子とその基質化合物を同定した．その中で，ヒドロキシ基のスルホン化反応（O-スルホン化）やアミノ基のスルホン化（N-スルホン化）とは異なる，α,β-不飽和カルボニル基のC-スルホン化反応を発見した^4）．本稿では，第三のスルホン化反応であるα,β-不飽和カルボニルスルホン化反応と最近報告されたスルホン化反応の新たな機能性について解説する．

21種報告されているマウスSULT遺伝子のうち，SULT4A1などの基質不明な酵素や生理機能が明らかにされていないSULTが複数存在する（図1B）^2）．SULT7A1も基質不明の酵素であったが，我々は最近，この酵素の基質を同定することに成功した．SULT7A1はこれまでのSULT酵素が標的官能基とするヒドロキシ基やアミノ基を有する化合物にはまったく活性を示さないが，α,β-不飽和カルボニル基を有する2-シクロヘキセノンや2-シクロペンテノンに対する特異的な硫酸転移酵素活性を有することを明らかにした（図2A）．そこで，SULT7A1の内因性基質化合物を探索した結果，2-シクロペンテノン構造を有するシクロペンテノン型プロスタグランジンに活性を示すことを明らかにした（図2B）．シクロペンテノン型プロスタグランジンは，炎症・疼痛・免疫・血管拡張・血小板凝集・胃粘膜保護・睡眠調節など，多様な生理機能を有するプロスタグランジンE（prostaglandin E：PGE）とプロスタグランジンD（prostaglandin D：PGD）から生合成される生理活性脂質である^5）．PGE₂からはPGA₂が合成され，PGD₂からはPGJ₂，Δ¹²-PGJ₂，そして，15-デオキシ-Δ¹²,¹⁴-PGJ₂（15d-PGJ₂）が合成される．その中でも，15d-PGJ₂は生理機能がよく研究されているシクロペンテノン型プロスタグランジンであり，α,β-不飽和カルボニル基の求核性のβ位の炭素を介して核内因子κB（nuclear factor-κB：NF-κB）やペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ：PPARγ）などと共有結合することで，抗炎症や抗腫瘍，抗ウイルス作用，そして，神経細胞分化・保護作用を有する^6）．そのため，SULT7A1によるα,β-不飽和カルボニル基のスルホン化反応は，プロスタグランジンおよびシクロペンテノン型プロスタグランジンの機能を制御することが想定された．

図2 SULT7A1のα,β-不飽和カルボニル特異的なスルホン化反応

（A）SULT7A1はα,β-不飽和カルボニル基を有する2-シクロヘキセノンと2-シクロペンテノンのみに酵素活性を示した．（B）SULT7A1の内因性基質として四つのシクロペンテノン型プロスタグランジンを同定した．（C）15d-PGJ₂スルホン化体の構造解析の結果，O-スルホン化体ではなくC-スルホン化体であることが判明した．（文献4をもとに改変して作成）．

そこで，15d-PGJ₂のスルホン化反応物に対して質量分析および核磁気共鳴分析を行った結果，当初想定していたα,β-不飽和カルボニル基の酸素原子ではなく，α位の炭素にスルホン基が付加した構造であることが判明した（図2C）．さらに，この反応産物を硫酸エステル加水分解酵素であるスルファターゼで処理したところ，スルホン基の脱離がまったく確認できなかったことから，SULT7A1はα,β-不飽和カルボニル基のC-スルホン化を触媒する酵素であると結論づけた．このC-スルホン化の発見により，硫酸転移酵素はO-スルホン化とN-スルホン化だけでなく，C-スルホン化も触媒しうることが明らかになった．

SULTによるO-スルホン化は，すべての硫酸転移酵素に共通の触媒残基Hisによって脱プロトン化された基質分子の酸素原子が，スルホン基供与体PAPSの硫黄原子を求核攻撃することで触媒される求核置換反応S_N2であることが提唱されている^7）．そこで我々は，SULT7A1によるα,β-不飽和カルボニル基に対するC-スルホン化反応の反応機構の手がかりを得るため，SULT7A1の結晶構造解析を行った．全体的な構造としては，他のSULT酵素と類似していたが，触媒残基であるHis94がCys234と水素結合を形成していた（図3A, B）．このCys234は基質が酵素内部に侵入する際のGate（入り口）形成として機能するループ構造中に存在する．このループ構造はB-factor値（原子の熱振動の大きさを表す温度因子）から，柔軟性の高い構造であることも明らかになっている（図3A）．触媒機構を詳細に理解するため，分子動力学シミュレーション解析から推定したオープン型構造（基質侵入時の構造）と15d-PGJ₂のドッキングシミュレーション解析を行った．その結果，基質認識ポケット部位が判明し，His94とCys234のほか，His51も基質認識や触媒に重要なアミノ酸であることが推定された（図3C）．部位特異的変異酵素を用いた実験から，上記三つのアミノ酸残基が酵素反応に必要不可欠であることが実際に示されたことから，現在のところ，図3Dに示すような3ステップからなる反応機構を推定している．簡潔に各ステップを記すと，①基質侵入により，His94がCys234のプロトンを引き抜き，活性化されたCys234のチオール基がβ位炭素を求核攻撃する．②求核攻撃によって電子対がα位炭素に移り，PAPSの硫黄原子への求核置換反応が生じる．③His51によるCys234への求核攻撃により，Cys234とβ炭素との共有結合が解除され，最終的に，触媒反応が完結する．

図3 α,β-不飽和カルボニル基スルホン化の反応機構と生理機能解析

（A）SULT7A1の立体構造は一般的なSULT酵素と類似しているが，立体構造の中心から下部にかけて存在する赤色のループ構造を有している．この赤色ループはB-factorが高く，柔軟性の高い構造である．（B）SULT7A1の触媒残基His94はCys234と水素結合を形成しており，触媒反応にはこの水素結合の解除が必要となる．（C）15d-PGJ₂はB-factor値の高いループ構造がオープン型のとき，活性中心部位に配置されることが可能となる．（D）SULT7A1によるα,β-不飽和カルボニル基C-スルホン化の提唱反応機構．（E）SULT7A1は小腸の柔毛上皮細胞特異的に発現する（in situ hybridization）．（F）15d-PGJ₂スルホン化体はPGI₂受容体IPのアンタゴニスト活性を示した．（文献4をもとに改変して作成）．

次に我々はSULT7A1によるプロスタグランジンC-スルホン化の生理機能を理解するため，SULT7A1の発現解析を行った．その結果，十二指腸と小腸（特に，空腸）の繊毛上皮細胞に特異的に発現する酵素であることが明らかになった（図3E）．次に，プロスタグランジンとしての生理機能を解析するため，15d-PGJ₂のスルホン化体のプロスタグランジン受容体に対する作用を解析した．その結果，15d-PGJ₂スルホン化体は，PGE₂受容体であるEP2やEP4, PGI₂受容体であるIPにはアゴニスト活性を示さなかったが，PGD₂受容体であるDP1には，15d-PGJ₂と同程度の弱いアゴニスト活性を示した．一方，受容体に対するアゴニスト処理時に15d-PGJ₂スルホン化体を同時添加したアンタゴニスト活性試験の結果，15d-PGJ₂スルホン化体はIPに対するアンタゴニスト活性を示した（図3D）．このアンタゴニスト活性は15d-PGJ₂にはない作用であるため，スルホン化を受けることで新たに獲得する生理機能であることが明らかになった．IPは血管の恒常性維持を担っており，その破綻は腸管虚血，そして，炎症性腸疾患を引き起こす可能性がある^8）．また，急性炎症や免疫系を制御することが示唆されている^9）．以上の結果より，15d-PGJ₂のC-スルホン化は，腸管血管の恒常性と炎症を制御していることが考えられた．

SULT7A1はほとんどの哺乳動物が有する酵素であるが，ヒトを含めた多くの霊長類では，機能しない偽遺伝子となっている．そのため，SULT7A1が触媒するようなα,β-不飽和カルボニル基のスルホン化（C-スルホン化）は，他のSULT酵素で報告されていないため，当該反応がヒトで起こる反応であるか不明であった．そこで，ヒトSULT酵素を用いてα,β-不飽和カルボニル化合物のスルホン化反応を検討した結果，SULT1A3, SULT1B1, SULT1C2，そして，SULT1C4が六員環構造を有する2-シクロヘキセノンをスルホン化することが明らかになった．このことから，ヒトにおいてもα,β-不飽和カルボニル基のスルホン化（C-スルホン化）が起きていることが考えられた．上記の4種類の酵素は，フェノール性の化合物のスルホン化を触媒する酵素であり，現在，ヒトSULT酵素によるα,β-不飽和カルボニル構造を有するフェノール性酸化代謝物のスルホン化反応の研究を進めている．

α,β-不飽和カルボニル構造はステロイドホルモンの一種であるケトステロイド類にもよくみられる構造である．ステロイドホルモンのスルホン化を担うSULT酵素であるSULT2A1による酵素活性試験を行った結果，ヒドロキシ基を持たないアンドロステンジオンや糖質コルチコイドであるコルチコステロンなどもスルホン化を受けることをすでに報告している^10）．

これからの結果から，酵素が基質構造を認識することができるα,β-不飽和カルボニル化合物であれば，スルホン化反応を触媒することができることが想定された．SULT7A1以外のα,β-不飽和カルボニル基のスルホン化反応の触媒機構は不明ではあるが，SULT7A1以外の酵素もα,β-不飽和カルボニル化合物をスルホン化できることが明らかにされたことから，本反応は多くの生物種にも起こりうる反応であると考えている．

SULT酵素によってスルホン化された多くの分子は，生理機能を失い，排泄されるだけの代謝物として，基本的には認識されている．しかし，近年，スルホン化15d-PGJ₂以外にも，コレステロール硫酸体による免疫抑制作用^11）や胆汁酸硫酸体による免疫細胞分化と腸内免疫制御^12）など，スルホン化代謝物が新たな生理機能を獲得し，生体機能調節作用を発揮する例が報告されている．一方，チロシン代謝物である4-エチルフェノール硫酸体がオリゴデンドロサイトの成熟化や神経軸索のミエリン化を阻害し，自閉症スペクトルを引き起こすことが報告されている^13）．今後，スルホン化代謝物の生理機能や疾患との関連性が明らかにされ，単なる不活性化ではない生理活性の制御機構として，よりいっそう，理解が深まることが期待される．

α,β-不飽和カルボニルやα,β-不飽和アルデヒド化合物は，過酸化代謝物として生み出されるだけでなく，酸化ストレスを誘発する分子としてもよく研究されている^14）．そのため，α,β-不飽和カルボニル基を標的としたスルホン化反応は，酸化ストレスに対する防御機構としての側面も有することが想定される．また，自然界には多くのC-スルホン化体が見いだされているほか，亜硫酸イオンによる非酵素的な反応で生じるC-スルホン化代謝物なども報告されており^15），微生物におけるC-スルホン化の研究や亜硫酸イオンによる非酵素的なC-スルホン化代謝と酵素的なC-スルホン化代謝の役割など，今後，さらなるα,β-不飽和カルボニル基のスルホン化とC-スルホン化の生理機能が解明されることが期待される．