生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

生命活動の基盤である遺伝情報は，外的要因のみならず，生体内で生じる多様な内的要因によっても絶えず損傷を受けている．近年，この内的要因として注目を集めているのが，生体内で発生する活性アルデヒド類である．アルデヒド類は高い反応性を有し，DNAやタンパク質と共有結合を形成することで，さまざまな損傷を引き起こす．アルデヒド類の中で最も単純な構造を持つホルムアルデヒド（formaldehyde：FA）は，ヒストンやDNAの脱メチル化反応，一炭素代謝などの生理的な代謝過程で産生され，ヒト血漿中のFA濃度は数十µMと見積もられている^1）．

FAは主に2種類のDNA損傷を引き起こすことが知られている．一つはDNA-DNA鎖間架橋（interstrand crosslink：ICL）で，DNAの相補鎖間を架橋する損傷である．もう一つはDNA-タンパク質間架橋（DNA-protein crosslink：DPC）で，DNAとタンパク質を共有結合により結合させる損傷である．これらのDNA損傷は，DNA複製や転写を物理的に阻害するため，細胞の生存に重大な影響を及ぼす^2）．

生体は，内因性FAに対して二重の防御機構を備えている．第一の防御線は代謝酵素による解毒システムであり，その主要な酵素としてADH5（alcohol dehydrogenase 5）とALDH2（aldehyde dehydrogenase 2）が知られている．ADH5はグルタチオン依存性のFA代謝酵素であり，ALDH2は主にアセトアルデヒドの代謝酵素として知られているが，FAの代謝にも関与することが明らかになってきた．特にALDH2は，日本人を含む東アジア人の約40％が保有する一塩基多型rs671（c.1510G＞A, p.E504K）により，その酵素活性が著しく低下することが知られており，この多型は，飲酒によって起こる顔面紅潮や吐き気などのアルコールフラッシング反応の原因として広く知られている．

我々は，小児期より造血不全を示す患者のゲノム解析を行い，アルデヒド代謝関連酵素であるADH5とALDH2の同時2遺伝子変異が，小児期から造血不全，知的障害，重度の低身長・小頭症を呈するAMeD症候群（aplastic anemia, mental retardation, and dwarfism）の発症原因であることを見いだした^3）．さらに，患者の臨床症状ならびに疾患モデルマウスの解析から，ALDH2の一塩基多型rs671のコピー数が，AMeD症候群の臨床症状の重症度を規定することを明らかにした．これらの知見は，AMeD症候群においてFAの代謝異常により細胞内FA濃度が上昇し，その結果としてFA由来のDNA損傷が過剰に蓄積することを示唆している．

第二の防御線はDNA修復システムである．ICLの修復は，ファンコニ貧血経路と呼ばれるDNA複製依存的な修復機構によって行われる^4）．ファンコニ貧血経路の構成因子の遺伝子変異は，造血不全を主徴とする遺伝性疾患ファンコニ貧血の原因となり，現在までに少なくとも22個の責任遺伝子が同定されている^5）．興味深いことに，アルデヒド代謝経路とFA経路の両者を欠損したマウスモデルは，造血幹細胞の枯渇を含むファンコニ貧血患者の臨床症状と酷似した表現型を示す．このことは，内因性アルデヒドによるDNA損傷の蓄積がファンコニ貧血の発症原因となることを強く示唆している^{6, 7）}．一方，DPCの修復においては，DNA複製と共役して機能するメタロプロテアーゼSPRTN（SprT-like domain at the N terminus）が中心的な役割を果たす．SPRTNは，DPCを構成するタンパク質を特異的に分解することで修復を促進する．実際，SPRTN遺伝子の変異は，早期老化と肝細胞がんを主症状とするRuijs-Aalfs症候群の原因となることが報告されている^{8, 9）}．しかし，このDPC修復経路は比較的最近同定されたものであり，その分子メカニズムの全貌は明らかになっていない．

AMeD症候群では，アルデヒド代謝異常によりDNA修復システムに過剰な負荷がかかることが原因であり，一方，ファンコニ貧血では内因性アルデヒドによって生じるICLを修復できないことが疾患発症の原因と考えられている^{6, 7）}．つまり，AMeD症候群とファンコニ貧血は，表裏一体の関係にある遺伝性疾患であり，AMeD症候群の一部の症状については過剰なICLによるものと考えられる．事実，造血不全や色素沈着が両遺伝性疾患の共通する臨床症状としてあげられる^3）．一方，AMeD症候群では，ファンコニ貧血では認められない特徴的な臨床症状として，知的障害や重度の低身長・小頭症があげられる．これらの症状は，ICL由来ではなく，FAによって誘導されるもう一つのDNA損傷である，DPCの蓄積による修復経路の過負荷が原因であることが予想される．そこで我々は，これまで解析が困難であったDPCの修復機構を明らかにすることで，AMeD症候群の分子病態の理解が進むと考えた．最近，我々の研究グループを含む3グループが，FAにより生じるDPCの修復機構とその生理的意義について明らかにしたので，本稿ではその内容を中心に概説したい^10–12）．

アルデヒドにより誘導されるDPCの修復機構を解明するため，我々は新規解析手法DPC-seq（DNA-protein crosslink sequencing）を確立した．本手法は，KCl/SDS沈殿法によるDPC特異的な精製と次世代シーケンシング解析を組み合わせることで，ゲノム上のDPC分布を高解像度で検出することを可能とした（図1A）．DPC-seqを用いてFA処理後のDPC修復動態を解析したところ，遺伝子の転写が活発な領域で，DPCが優先的に除去されることが明らかとなった（図1B, C）．さらに詳細な解析により，この転写共役型DPC修復の効率は，遺伝子の発現量と正の相関を示し，一方で遺伝子の長さとは負の相関を示すことがわかった．つまり，発現量が高い遺伝子ほどDPC修復が効率的に行われ，遺伝子が長いほど修復効率が低下する傾向が認められた．また，RNAポリメラーゼII（RNAPII）の転写阻害剤である5,6-dichlorobenzimidazole1-β-D-ribofuranoside（DRB）やtriptolide処理によってDPCの除去が抑制された（図1B, C）．これらの知見は，DPC修復がRNAPIIを介した転写と共役して進行することを示している．

図1 CSB依存的な転写共役型DPC修復

（A） DPC-seq：FAを処理した細胞から遊離DNAを除き，DPCを単離・精製した後に，次世代ゲノム解析を実施．（B）得られたリードをマップしゲノムビューアを用いて視覚化．転写が活発な遺伝子領域ではDPCが修復されている．（C） DPCリードをゲノムにマッピングしたmetageneプロット．転写阻害剤であるDRBやtriptolideを処理することで，FA処理4時間後のDPC修復が阻害されている．（D） FA処理後に転写伸長中のRNAPIIと相互作用するタンパク質を同定するためのインタラクトーム解析．（E） DPCリードをゲノムにマッピングしたmetageneプロット．野生型（WT），CSB欠損細胞（ΔCSB），CSB欠損細胞にCSBの野生型コンストラクトを安定発現させた細胞（ΔCSB＋CSB-WT）．野生型細胞とCSB欠損細胞とを比較したとき，FA処理後の回復時間が0時間（0時間サンプル）では違いはないが，回復時間が4時間（4時間サンプル）の場合，CSB欠損細胞では転写領域でのDPC修復が遅延している．文献10より改変．

次に，転写領域でのDPC修復に関与する因子の同定を試みた．FA処理後，損傷部位で停止したRNAPIIと相互作用するタンパク質を，質量分析を用いたインタラクトーム解析により網羅的に探索した．その結果，早期老化症状を示すコケイン症候群の原因遺伝子産物CSB（Cockayne syndrome B）が，FA依存的にRNAPIIと相互作用することを見いだした（図1D）．CSBは転写と共役したDNA修復（transcription-coupled repair：TCR）の中心的因子であり，主に紫外線誘発DNA損傷の修復を介してRNAPIIの転写再開を促進することが知られている．近年，CSBの欠損がFAに高い感受性を示すことが報告されているが，FAによって誘導されるDNA損傷に対するCSBの分子機能は未解明であった^{13, 14）}．そこで，CSBの機能をより詳細に解析するため，CRISPR-Cas9ゲノム編集法によって作製したCSB欠損細胞を用いて，DPC-seq解析を行った．その結果，CSB欠損細胞では転写領域でのDPC修復が顕著に遅延することが判明した（図1E）．特に，発現量の高い遺伝子や長さの短い遺伝子において，その効果が顕著であった．これらの結果は，CSBが転写共役型DPC修復に必須の因子であることを示している．

DPCの修復には架橋したタンパク質の分解が必須であると考えられることから，その分子機構を明らかにするため，さまざまなタンパク質分解阻害剤を用いた解析を行った．その結果，ATPase活性依存的にタンパク質の構造変化や分解を促進するVCP（valosin-containing protein）/p97の阻害剤であるCB5083やNMS873，およびプロテアソーム阻害剤であるepoxomicinやMG262の処理により，転写領域でのDPC修復が顕著に遅延することが明らかとなった．さらに，これらの阻害効果はCSB欠損細胞では認められなかったことから，VCP/p97とプロテアソームはCSBと同じ経路で機能することが示唆された．

細胞核内でDNAは，H2A, H2B, H3, H4の4種類のコアヒストンからなるヒストン八量体に約147塩基対のDNAが巻きついたヌクレオソーム構造を形成している．ヒストンはDNAと密接に接触していることから，FAによってヒストンとDNAが共有結合したDPC（ヒストン-DPC）が形成される可能性を考えた．そこで，抗ヒストンH2B抗体を用いた免疫沈降とDPC-seqを組み合わせた解析を実施することで，ヒストン-DPCの生成と修復動態の解明を試みた．その結果，FA処理によってヒストン-DPCが生成され，その修復が転写活性の高い領域で優先的に行われることが明らかとなった．さらに，この修復過程もCSB依存的であることが示され，ヒストン-DPCが転写と共役した修復機構の主要な基質の一つであることが示唆された．

FAによるDNA損傷後のRNAPIIのインタラクトーム解析からは，もう一つの重要な因子として転写伸長因子TFIIS（transcription factor IIS）を同定した（図1D）．TFIISは，RNAPIIがDNA上で停止・後退（バックトラック）した際に，RNAPIIが持つRNA切断活性を促進することで転写の再開を補助する因子として知られていた^15）．興味深いことに，質量分析を用いたインタラクトーム解析では，TFIISとRNAPIIの相互作用がFA処理後に特異的に観察され，紫外線照射ではみられなかった．この特異性を検証するため，HeLa細胞においてsiRNAを用い発現抑制したところ，FA処理に対して高い感受性を示したが，紫外線照射には感受性を示さなかった．さらに，TFIISのRNA切断活性を欠損した変異体（D282A/E283A）では，FA感受性を相補することができなかった．これらの結果は，TFIISがそのRNA切断活性依存的に，FA由来のDPCに特異的な転写再開因子として機能することを示している．

次に，これまでに明らかとなった転写共役型DPC修復の生理的意義を個体レベルで検証するため，マウスモデルを用いた解析を行った．まず，AMeD症候群モデルマウス（Adh5^−/−Aldh2^KI/KI）の骨髄細胞を用いてDPC量を測定したところ，野生型と比較して有意な増加が認められた（図2A, B）．このことは，アルデヒド代謝酵素の欠損により，生体内でDPCが蓄積することを示している．次に，アルデヒド代謝と転写共役型DNA修復の関係をより詳細に解析するため，CSB欠損を加えた三重変異マウス（Adh5^−/−Aldh2^＋/KICsb^−/−）を作製した．このマウスは，それぞれの単独変異マウスと比較して，成長障害，生存期間の短縮，赤血球数の減少が確認された（図2C）．さらに，フローサイトメトリーを用いて造血幹細胞・前駆細胞の割合を検証したところ，三重変異マウスでは造血幹細胞や多能性造血前駆細胞，リンパ系共通前駆細胞などの未分化な造血細胞が顕著に減少していることが明らかとなった（図2D）．さらに，これらの骨髄細胞を用いたDPC-seq解析により，DPCが転写活性の高い領域で優先的に修復されること，三重変異マウスでは転写領域でのDPC修復効率が顕著に低下していることが明らかになった（図2E）．また，生体内でのDPC修復効率は，培養細胞を用いた実験結果と同様に，遺伝子の転写量と正の相関を示すことが確認された（図2F）．これらの結果は，CSB依存的な転写領域でのDPC修復機構が生体内でも機能しており，個体恒常性の維持に重要な役割を果たすことを示唆している．

図2 アルデヒド代謝異常と転写共役型DNA修復欠損の生体影響

（A） in vivo DPC-seq：個体レベルでの内因性アルデヒド由来DPC解析の実験手順．（B）野生型（WT）およびAMeD症候群モデルマウス（Adh5^−/−Aldh2^KI/KI）の骨髄細胞でのDPC定量．（C）アルデヒド代謝と転写共役型DNA修復の機能不全マウスのカプランマイヤー生存曲線．（D）アルデヒド代謝と転写共役型DNA修復の機能不全マウスの造血幹細胞の割合．（E）マウス骨髄細胞から得られたDPCリードをゲノムにマッピングしたmetageneプロット．（F）マウス骨髄細胞から得られたDPC-seqリードのカウント結果．文献10より改変．

本研究により，内因性アルデヒドによって生じるDPCの新規修復経路として，転写共役型DPC修復機構（TC-DPCR）を同定した．TC-DPCRは，紫外線損傷に対する従来の転写共役型ヌクレオチド除去修復（TC-NER）とは異なる特徴を持つことも明らかとなった．特に，TFIISの関与はFA特異的であり，これまで知られていなかった転写と修復の関係性を示している．このことは，DNA損傷の種類によって，異なる転写再開機構が存在することを示唆している．本研究ではさらに，ヒストン-DPCという新しいタイプのDNA損傷の存在とその修復機構を明らかにした．ヒストンは核内で最も豊富なタンパク質であり，DNAと密接に相互作用していることから，内因性アルデヒドによるDPC形成の主要な標的となっている可能性が高く，ヒストン-DPCのより詳細な修復分子メカニズムの解明が期待される．

また，TC-DPCRの同定は，これまで不明であったAMeD症候群とコケイン症候群の分子病態の共通基盤を明らかにした点でも重要な意義を持つ．AMeD症候群ではアルデヒド代謝能の低下によりDPCが蓄積し，TC-DPCRに過剰な負荷がかかることで疾患が発症すると考えられる．一方，コケイン症候群では，TC-DPCRの破綻により，内因性アルデヒドに由来するDPCを効率的に除去できないことが病態の一因となっていることが示唆された．今後，TC-DPCRの分子メカニズムのさらなる解明が，これらの疾患の治療法開発につながることが期待される．