生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

植物は独立栄養生物であり，光合成により空気中の二酸化炭素を糖に固定できる．しかしながら，我々を含む従属栄養生物はほかの生物から有機化合物を摂取することでしか炭素を得ることができない．そのため，植物病原菌は植物が合成した糖の奪取に挑み，一方で植物は病原菌に渡さないように糖を死守する．このような糖を巡る植物と病原菌の攻防は葉や根など植物全体で繰り広げられており，糖は植物–病原菌間相互作用を形成するための鍵となる分子である．

糖は，エネルギー源やほかの化合物の骨格としての役割以外にも，シグナル分子として働くことが多くの生物で知られている．たとえば，糖は病原細菌の病原力因子の発現誘導を介して病原力を高める．また，植物細胞内では糖は免疫力を向上させるため，糖を処理することで植物の抵抗性を高めることも行われてきた^1）．糖が植物の免疫応答を活性化させる分子機構はこれまで未解明であったが，近年，筆者らはその分子機構の一端を見いだし報告した^2）．そこで本稿では，植物の免疫応答における糖のシグナル分子としての機能など，糖が植物–病原菌間相互作用の形成に与える影響を解析した研究を紹介したい．

生理学的な解析から，植物病原菌が感染した植物細胞から糖を吸収していることは知られていたが，その分子機構や病原力との関わり合いは長らく不明だった．病原細菌は，注射器のような構造を持つIII型分泌装置を宿主細胞へ突き刺し，「病原力因子」または「エフェクター」と呼ばれるタンパク質を宿主細胞へと直接注入する．そして，エフェクターは宿主細胞の免疫応答の抑制を介し，宿主の体内を病原細菌の増殖しやすい環境へと整えることで感染を可能にしている．Xanthomonas属の病原細菌はTAL（transcription activator-like）エフェクターと呼ばれるDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインを持つタンパク質を宿主植物細胞内へ分泌し，宿主細胞内の特定の遺伝子を強制的に発現させる（TALエフェクターの特性はゲノム編集ツールのTALENとして応用されている）．TALエフェクターによって強制的に発現させられる遺伝子は，病原細菌の感染を促進させる機能を持つため，総称してS（susceptibility）遺伝子と呼ばれている．2010年に促進拡散型の新規糖トランスポーターとしてSWEETが同定されたが，イネのSWEETの相同遺伝子にはイネ白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）のTALエフェクターによって誘導されるS遺伝子のXa13（後にSWEET11とされた）が存在し，イネ白葉枯病菌は宿主植物の糖輸送を利用して病原力を高めていることが見いだされた^3）．そして，TALエフェクターの標的として同定されたイネのSWEET11, SWEET13, SWEET14遺伝子のプロモーターをゲノム編集により改変し，TALエフェクターを介したSWEET遺伝子の発現誘導を阻止することで，多くのイネ白葉枯病菌の株に対する抵抗性をイネに付与することにも成功している^4）．イネ白葉枯病菌はTALエフェクターによってSWEET（特にクレードIIIに分類されるスクロースを輸送基質とするSWEET）を誘導し，イネ細胞内のスクロースを細胞外へ排出させることで糖を摂取すると考えられている．さらに，イネ白葉枯病菌以外のXanthomonas属の細菌が有するTALエフェクターも宿主植物のSWEET遺伝子を標的としていることから^5），宿主植物のSWEET遺伝子を標的とした糖摂取戦略はXanthomonas属に共通した感染戦略であることが推察される．

病原細菌だけでなく，病原糸状菌の病原力にも糖は関与している．たとえば，トウモロコシ黒穂病菌（Ustilago maydis）の感染にはスクローストランスポーターSrt1が必要であることも知られている^6）．その他の病原糸状菌の病原力に関与する糖トランスポーターの報告もされており^7），糖は植物病原菌の感染・増殖にとって不可欠なものであることがうかがえる．

病原菌が戦略的に感染時に宿主植物から糖を吸収する一方で，植物がそれに対抗する防除機構を備えていることを筆者らは見いだし報告している^8）．他の生物と同様に，植物も非自己分子の認識を介して免疫応答を発動させる．たとえば，免疫応答を活性化させる代表的な非自己分子として細菌のべん毛を構成するタンパク質のフラジェリン，植物側の受容体としてフラジェリンのN末端の22アミノ酸を認識するFLS2があげられ，植物免疫研究の中ではフラジェリン-FLS2を介した植物免疫シグナルの解析が特に進んでいる．

筆者らは免疫応答時の植物の糖吸収活性に着目し，フラジェリン由来のペプチドをモデル植物のシロイヌナズナに処理し，糖吸収活性を測定した結果，免疫応答の活性化を介してグルコースやフルクトースなどの単糖吸収活性が高まることを見いだした．そしてその分子機構として，単糖トランスポーターSTP13の転写活性化およびタンパク質のリン酸化を介した糖吸収活性の増強によるものであることを明らかにした（図1）^8）．

図1 植物の糖吸収制御を介した病原菌の糖摂取阻害機構

病原細菌は気孔や傷口から葉の内部に侵入する．植物細胞は，（1）病原菌を認識後，（2）単糖トランスポーターSTP13の転写活性化やリン酸化修飾を介して，（3）糖吸収活性を増強させる．細胞外の二糖スクロースはインベルターゼによって加水分解され，単糖のグルコースおよびフルクトースとなりSTP13に吸収される．（4）細胞外の糖が減少することで，病原菌の糖摂取が阻害される．

多くの植物では，光合成により産生した糖をスクロースの形で非光合成組織へ輸送・分配する．植物細胞は原形質連絡と呼ばれる細胞間のトンネル構造によりつながっており，糖などの溶質はこの構造を通じて隣接する細胞へ近距離輸送される．一方で，組織間での長距離輸送には，篩管や導管により構成される維管束組織を経由する．しかし，光合成を行う葉肉細胞と輸送を担う維管束組織は原形質連絡でつながっていないケースが多く，維管束組織に糖を積み込む際には一度細胞外へと糖を排出する必要があるため，植物細胞間隙には糖の蓄積が観察される．植物病原細菌は，気孔や傷口から葉内へ侵入後，植物細胞間隙でそのような糖を吸収し増殖すると考えられている．

筆者らは，上述のようにフラジェリンを処理することでシロイヌナズナの単糖吸収活性が増加することを見いだしたことから，植物は単糖吸収の増強を介して細胞外の糖を減少させ，病原細菌の糖摂取を阻害していると考えた．植物細胞外には二糖のスクロースが蓄積している．STP13は単糖トランスポーターだが，免疫活性化時には二糖のスクロースを加水分解し単糖のグルコースとフルクトースを生成するインベルターゼの活性も，STP13依存的な単糖吸収活性とともに増加することから，植物はスクロース加水分解後の単糖をSTP13により吸収することで細胞外の糖の量の調節を行っていると推察された（図1）．

病原細菌はIII型分泌装置を介し植物の免疫応答を撹乱するエフェクターを分泌する．エフェクターの発現は植物感染時特異的であり（通常の培地中ではエフェクターは発現しない），植物体侵入時の糖の認識がエフェクター誘導のトリガーとなる^9）．そこで植物の糖吸収と病原細菌のエフェクター分泌との関係性を調べたところ，吸収型の糖トランスポーター遺伝子を破壊した植物（STP13およびホモログのSTP1を破壊した植物）に感染した病原細菌は，野生型植物に感染した場合よりも，エフェクター分泌量が高いことが観察された．これらの結果より，植物の糖吸収は，栄養源としての病原細菌の糖摂取を阻害するだけでなく，エフェクターの分泌量も低下させることで病原細菌の病原力も低下させていることが明らかにされた^8）．

また，糖以外に，アミノ酸によっても病原細菌のエフェクターの分泌が促進される．近年，植物は細胞外のプロリンを吸収することでも病原細菌のエフェクター誘導を抑えていることが報告され^10），細胞外の代謝物量のコントロールは重要な植物の防御機構であることが示されている．

免疫応答は，さまざまな出力を伴うエネルギーコストの高い反応であり，強固な免疫応答を維持するには細胞内に十分なエネルギーやそれを生み出す代謝物が必要であると考えられる．上述のように，免疫応答時には糖トランスポーターの活性化に伴い細胞外の糖が低下するが，このことは同時に細胞内の糖の増加を意味している．この点に着目し，筆者らは細胞内の糖の量が免疫応答に与える影響を解析した．まず，吸収型の糖トランスポーター遺伝子破壊植物にフラジェリン由来ペプチドを処理し，網羅的遺伝子発現解析を行った結果，多くの免疫関連遺伝子の発現が低下していることが見いだされ，細胞内の糖が植物の免疫応答に影響を与えることが示唆された．さらには，グルコースをシロイヌナズナに処理するのみでも，免疫関連遺伝子の発現誘導が弱いながらも検出され，細胞内のグルコースが免疫応答に関与していることが推測された．しかし，グルコースはさまざまな代謝経路の基質となるため，どの代謝ステップまたは代謝物が免疫応答に関与するかを特定するのは容易ではない．そこで，非代謝性のグルコース類似体である2-デオキシ-D-グルコース（2DG）や3-O-メチル-D-グルコース（3OMG）をシロイヌナズナに処理し，遺伝子発現解析を行った結果，2DG処理時にのみ免疫関連遺伝子の発現誘導が検出された．3OMGとは異なり，2DGは糖リン酸化酵素のヘキソキナーゼの基質となることから，この結果は糖誘導性の免疫応答にはヘキソキナーゼが関与することを示唆している．シロイヌナズナのヘキソキナーゼHXK1は糖リン酸化酵素としての役割に加え，糖受容体として糖シグナルを活性化する機能を持ち，その際には糖リン酸化能は必要としないことが報告されている^11）．植物細胞内では，2DGはヘキソキナーゼによりリン酸化され，2DG 6-リン酸となるが，それ以上は代謝されない．このため，2DG誘導性の免疫応答は「糖リン酸化酵素HXK1による2DG 6-リン酸の生成」，もしくは「糖受容体HXK1による2DGの認識」によるものだと推測された．そして，糖リン酸化能を破壊したHXK1では2DG誘導性の免疫応答を誘導できなかったことから，「糖リン酸化酵素HXK1による2DG 6-リン酸の生成」が免疫応答を誘導する要因であると考えられた．

次に筆者らは，2DG誘導性の免疫関連遺伝子の発現に関与する因子として，カルシウム依存性プロテインキナーゼのCPK5を同定した．さらに，シロイヌナズナに2DGまたはグルコースを処理したところ，CPK5の自己リン酸化が増加することが観察され，糖がCPK5を活性化することが示唆された．CPK5は免疫応答に関与することが報告されており，上述の結果とあわせて，2DG 6-リン酸やグルコース6-リン酸の蓄積状況がCPK5に伝達されることで免疫応答の活性化が引き起こされると考えられた．CPKはC末端にEFハンドモチーフを持ち，カルシウムイオンの結合による構造変化を伴うことで活性化する．しかし，2DG処理をしても植物細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇は観察されなかったことから，糖処理時におけるCPK5の活性化はカルシウムイオン非依存的な制御によって調節されている可能性が示唆された．

そこで，CPK5の新規活性制御因子を単離するため，CPK5と相互作用するタンパク質の探索を行い，プロテインホスファターゼ2CのABI1を単離した．CPK5はABI1により脱リン酸化され，その基質リン酸化能が低下したことより，ABI1はCPK5の抑制因子であることが示された．さらに，糖とABI1の関連性を解析したところ，2DG 6-リン酸やグルコース6-リン酸がABI1の脱リン酸化能を低下させることを見いだした（図2A）．この結果から，細胞内のグルコース6-リン酸や2DG 6-リン酸の量が増加すると，ABI1が抑制され，CPK5の自己リン酸化が高まることでCPK5が活性化されるという，糖を介した免疫応答の活性化が明らかにされた（図2A, B）^2）．本結果は，細胞内の糖の量的情報が分子シグナル（ABI1の脱リン酸化活性）に変換され，それが直接的に植物免疫シグナル（CPK5の活性化）に影響を与える分子機構を示した初めての例である．

図2 糖の量的情報が免疫関連因子のプロテインキナーゼCPK5の自己リン酸化レベルに反映される

（A）プロテインホスファターゼABI1によりCPK5が脱リン酸化されるが，グルコース6-リン酸を加えることによりABI1の活性が阻害され，CPK5の自己リン酸化が回復する．（B）グルコースはヘキソキナーゼによってグルコース6-リン酸となり，グルコース6-リン酸の量が増加することでプロテインホスファターゼABI1の脱リン酸化活性が低下する．このことは，細胞内のグルコースの量的情報はABI1の活性の変動という分子シグナルに変換されることを示している．その後，ABI1の活性が低下することで，免疫応答に関与するプロテインキナーゼCPK5の自己リン酸化が増加し，CPK5の活性が高められることで，糖の情報が免疫応答へと伝達される．

しかしながら，免疫応答時にSTP13を介した糖吸収が活性化するタイミングでは，CPK5の自己リン酸化の増加は観察されなかった．このことから，糖によるCPK5の活性化は，STP13による糖吸収の下流に位置するものではないことが示唆された．STP13の活性化はフラジェリン由来ペプチド処理後8時間以降の免疫応答の中期から後期にみられるが，一方で糖によるCPK5の活性化はそれ以前のタイミングで関与することが考えられた．植物細胞では，病原菌分子の認識直後に細胞内にカルシウムイオンの流入が起き，CPK5の活性化が起きる．筆者らは，グルコースを事前にシロイヌナズナに処理しておくことで，CPK5を介した免疫初期応答（刺激後30分程度）が強化されることを明らかにした．これらの結果から，今回見いだされた機構は，病原菌が認識される以前に細胞内に糖が十分にある場合はCPK5を弱い活性状態にとどめておき（糖によるCPK5の活性化はカルシウムイオンを介した活性化に比べて弱い），病原菌を認識した際にすばやくかつ強い免疫応答を誘導させるためだと考えられた（図3）．

図3 糖はCPK5をプライミング状態にする

糖飢餓状態では，ABI1によってCPK5の活性が阻害されている（左図）．一方で糖が十分にある状況では，グルコース6-リン酸を介したABI1の活性阻害によってCPK5は脱抑制される（右図）．糖を介したCPK5の活性化はカルシウムイオンを介した活性と比較して強いものではないが，糖によりCPK5を弱い活性化状態に維持しプライミング状態にすることで，病原菌認識後にすばやくかつ強い反応が可能になると考えられる．

作物の病害被害の軽減を目指し，植物の免疫応答の研究が世界中で進められてきた．これまでの研究では，病原菌を認識する受容体から下流のプロテインキナーゼや転写因子まで，免疫応答の入力から出力までをつなげるタンパク質の単離・同定が主であった．しかし今回の筆者らの解析により，細胞内の代謝物が免疫応答に関与するタンパク質の活性を直接制御し，免疫応答の出力強度を決定していることが明らかとなった．本結果は，より強固な免疫応答を植物に付与するためには，植物細胞内環境をそれに適したものに整える必要があることを示している．今回，筆者らが明らかにしたのは糖が免疫応答に影響を与える分子機構の一端にすぎず，たとえばSTP13を介した糖吸収の下流に位置する因子については不明である．今後，細胞内の代謝物情報が分子シグナルに変換される機構や，さまざまな外部刺激シグナル経路に入力される機構の全体像が明らかにされ，これらの知見が作物の病害抵抗性を高める栽培法などにも活かされていくことが期待される．