生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

生物の基本単位である細胞は，内部に脂質膜で隔離され，それぞれに特異的な環境を持つ細胞小器官（オルガネラ）を持つ．教科書のイラストでは，オルガネラどうしが互いに離れて存在するように表現される．しかし，実際に電子顕微鏡（電顕）で細胞内を観察すると，オルガネラどうしはしばしば数十nm程度のきわめて近い距離に位置することがわかる．このオルガネラどうしの近接構造は膜接触場（membrane contact site：MCS）と呼ばれる．その中でも特に，ミトコンドリアと小胞体（ER）の間の接触場（mitochondria-ER contact site：MERCS）は酵母から哺乳類に至るまで真核生物全般に広く保存され，哺乳類細胞において最もよく観察される接触場でもある^1）．本稿では，ミトコンドリア–小胞体接触場の研究史を概観するとともに，我々が最近報告した研究成果について紹介する．

MERCSはラット肝臓の電顕観察により1950年代に初めて報告されたが^2），その当時，この構造の持つ意義は不明であった．しかし，約40年後の1990年，Vanceによる細胞分画法を用いたmitochondria-associated membrane（MAM）画分の単離によって生化学的解析が可能となり，MERCSが脂質の輸送と合成の場であることが提唱された^3）．さらに，同時期にRizzuto, Hajnóczkyらにより，MERCSがERからミトコンドリアマトリックスへの直接的なCa^2＋輸送の場であることが提案された^4）．このように，1900年代はMERCSの発見と，その生理的意義の提案がなされた，まさに接触場研究の萌芽期といえる．しかしながら，MERCSを形成する分子機構は不明であり，脂質制御やCa^2＋輸送におけるMERCSの必要性は未検証であった．

MERCSにおいては，ミトコンドリア外膜と小胞体膜は数十nmほど，という非常に近い距離（ミトコンドリア外膜–内膜間の距離が10～20 nmであることを考えると，非常に近いことが感じられるのではないだろうか）にまで近接していながら融合はしていない，“不自然な”構造である．このような構造を作るには両オルガネラ膜をつなぎとめる分子［テザー（tether）］の存在が示唆される．実際に2006年，Hajnóczkyらはクライオ電子線トモグラフィー（Cryo-ET）によってミトコンドリアとER様構造の間に存在するテザー様構造を直接観察した^5）．この結果より，テザーとして働くタンパク質の同定が望まれていた．

その3年後，Walterらは出芽酵母を用いたスクリーニングによりMERCS形成因子としてERMES複合体を同定した^{6）, 注}．さらにERMES複合体は，MERCSにおけるリン脂質の生合成に必要であることも示された^6）．このように2000年代は，酵母におけるMERCS形成遺伝子の同定により，酵母におけるMERCSの機能の研究が加速し始めた．

哺乳類細胞におけるテザーの同定も試みられ多くのMERCS局在タンパク質が明らかになってきたが，それらの欠損がMERCS量に与える影響は大きくなかった．そのような中，我々のグループは2017年，ERMES複合体のサブユニットの一つMmm1のパラログであるPdzd8のノックアウト（KO）によりHeLa細胞においてはMERCSの80％以上が消失することを見いだし，Pdzd8が哺乳類におけるMERCS形成の決定的因子として働くことを報告した^8）．加えて，Pdzd8によるMERCS形成の機能として，Pdzd8をノックダウン（KD）した神経細胞は，樹状突起におけるERからミトコンドリアへのCa^2＋輸送が顕著に減少することも報告している^8）．

以上の逆遺伝学的手法による証拠から，Pdzd8が哺乳類におけるMERCS形成およびCa^2＋輸送に必須の因子であることを明らかにした．しかし，細胞内においてPDZD8というタンパク質がどのようにMERCSという膜構造を制御するのかについて，つまり細胞生物学的レベルでの理解には至っていない．特にMERCSが，異なる二つのオルガネラ膜とさまざまなタンパク質が集まる特殊な場であることを鑑みると，オルガネラ膜レベルの解析手法とタンパク質レベルの解析手法を適切に使い分け，時には効果的に組み合わせることが重要である．次節では最近我々が発表した，PDZD8によるMERCS形成機構についての新たな知見^9）を，その解析手法にも着目しながら紹介したい．

1）PDZD8の生細胞内での動態は？

先行研究^8）において，内在PDZD8の一部がMERCS近傍とMAM画分に存在することは報告したものの，生細胞内でのPDZD8動態はまったく未知であった．そこで生細胞内でのPDZD8タンパク質の動きを追うために，蛍光ラベルしたタンパク質を高い時空間分解能で可視化できる，sptPALM（single particle tracking photoactivated localization microscopy）^10）を用いた単粒子追跡解析を行った［Janelia Research CampusのChristopher J. Obara博士（現UCSD），Jennifer Lippincott-Schwartz博士との共同研究］．その結果，興味深いことに，PDZD8は小胞体上をすばやく動く一方でミトコンドリア近傍では動きが顕著に遅くなっていた．このような挙動には「ミトコンドリア上の特定のタンパク質が直接的な相互作用によってPDZD8を捉えることが必要なのではないか」と仮説を立て，我々はPDZD8と直接結合するミトコンドリアタンパク質を探索した．

2）PDZD8のミトコンドリア側の結合パートナーは？

PDZD8と直接結合するミトコンドリアタンパク質を探索するため，免疫沈降–質量分析法（IP–MS）に加え，自身の20 nm以内をビオチン化標識する酵素である，TurboIDを用いた近接標識法（TurboID-MS）も行った．IP–MSは複合体全体の同定に優れる一方，直接結合因子の特定には限界があるため，近接標識法を併用した．さらに，CRISPR/Cas9で内在PDZD8にタグづけし，過剰発現によるアーティファクトを回避した．この結果，IP–MSおよびTurboID-MSの双方で検出されたタンパク質は12個に絞られ，ミトコンドリアタンパク質としてはFKBP8のみが同定された（徳島大学 小迫英尊教授，東京大学 岸雄介准教授，後藤由季子教授との共同研究）．

表面プラズモン共鳴（SPR）により調べたところ，PDZD8とFKBP8はK_D値＝142 µMの比較的ゆるい，可逆的な結合を示すことが明らかになった（東京大学 津本浩平教授，中木戸誠講師との共同研究）．

3）FKBP8はPDZD8をMERCSに連れてくるか？

FKBP8が内在PDZD8をMERCSに連れてくるかを検証するには，タンパク質の局在解析に用いる蛍光顕微鏡の空間解像度が課題となる．PDZD8がMERCSに局在する場合，ミトコンドリア外膜から数十nm以内に位置するはずであるが，通常の顕微鏡は数百nmの平面解像度しか持たない．そこで，ミトコンドリア近傍のPDZD8をより正確に同定するために，我々は超解像ユニットNSPARC（Nikon Spatial Array Confocal）を搭載した共焦点顕微鏡（Nikon AX）を用いた．その結果，Fkbp8 KO細胞ではミトコンドリアマーカーと重なる内在PDZD8の割合が顕著に減少することが明らかになった．さらに，ミトコンドリア上のFKBP8の十分性を明らかにするためにミトコンドリア上にのみ局在するFKBP8^N403K変異体（FKBP8はER上にも局在することが報告されていたため^11））を過剰発現させた．その結果，ミトコンドリア近傍に連れてこられた内在PDZD8の割合は顕著に増加した．

しかし，超解像顕微鏡の空間解像度でも数十nmのMERCSの観察には不十分であり，蛍光顕微鏡では膜構造を直接観察できない．そこでFKBP8^N403K変異体過剰発現によって引き寄せられたPDZD8は本当にMERCSにまで達しているのかを調べるために，3次元光–電子相関顕微鏡法（3D-CLEM）により，オルガネラ膜とタンパク質局在を同時に可視化したところ，内在PDZD8がMERCSに集積する様子が観察された．これら結果は，ミトコンドリア上のFKBP8が内在PDZD8をMERCSに連れてくるのに必要十分であることを示唆する．

4）FKBP8はPDZD8と協調的にMERCSを形成するか？

MERCS量の測定のためにはnmレベルの解像度を持つ，電顕による膜構造の直接観察が必須である．そこで，Pdzd8 cKO（コンディショナルノックアウト）細胞，Fkbp8 KD細胞，およびPdzd8 cKO＋Fkbp8 KD細胞のMERCSを走査型電顕（SEM）で可視化し定量した結果，いずれの群でもMERCS量が顕著に減少し，その程度は同等であった．これは，PDZD8とFKBP8が相互依存的にMERCSを形成することを強く示唆する．

上記の結果は，細胞を化学固定したものであり，固定過程における微細構造変化などの可能性を含む．そのため，最近急速に発展しているCryo-ETを活用し，near-nativeな状態のMERCS構造をÅレベルの空間解像度で解析した［New York Structural Biology Center（研究当時），現Chan Zuckerberg Imaging InstituteのMohammadreza Paaran博士，Clint Potter博士，Bridget Carragher博士との共同研究］．その結果，コントロール細胞に比べてFKBP8^N403K過剰発現細胞ではER膜–ミトコンドリア外膜間の距離が顕著に減少することを見いだした．

以上の結果はミトコンドリア上のFKBP8がPDZD8を捕まえることでMERCSが形成されることを強く示唆する（図1）．では，PDZD8–FKBP8複合体によるMERCSの機能は何か．

図1 PDZD8–FKBP8複合体によるMERCS形成モデル

ミトコンドリア上のFKBP8がPDZD8を捕まえることでMERCSが形成される．

MERCSの機能として，前述の脂質生合成とCa^2＋輸送に加えてミトコンドリア構造制御への寄与が議論されている．これは，MERCSにおいてミトコンドリア分裂頻度が高いという観察により支持されてきたが^12），最近，逆の現象であるミトコンドリア融合もまたMERCSにて高頻度で起こることが報告された^{13, 14）}．しかしこれまではMERCSを減らす手段がなかったため，MERCSがミトコンドリアを断片化するのに必要なのか，それとも長くつながった複雑な形態にするのに必要なのかは不明であった．そこでPDZD8およびFKBP8欠損細胞のミトコンドリア微細構造を解析し，MERCSのミトコンドリア形態制御における因果関係を検討した．

ここにも技術的懸念が存在する．ミトコンドリアの直径は500 nmほどであり，ミトコンドリアどうしは数十nmほどまで近接することがあるため，ミトコンドリア形態を包括的かつ正確に捉えるには，撮影範囲が数十µm以上かつnmレベルの解像度を持つ，3次元電子顕微鏡法（Volume EM）を用いる必要があった．しかし，Volume EMは画像解析のスループットが低く，解析可能なサンプル数が限られるため，多条件を対象とした統計的比較に利用された例は非常に少ない．そこで筆者らが樹立した，深層学習ベースの解析パイプラインPHILOW^15）と他グループによって開発されたempanada^16）を組み合わせることでハイスループット化を実現し，合計250個以上のミトコンドリアの3次元微細構造を抽出した．その結果，FKBP8がミトコンドリアを丸くすること，さらにPDZD8がその上流でFKBP8を阻害する形でミトコンドリアの複雑性を維持することが明らかになった（図2）．

図2 PDZD8–FKBP8複合体によるミトコンドリア構造の制御

コントロール細胞では，FKBP8のミトコンドリアを丸くする機能がPDZD8によって阻害されるために，ミトコンドリア構造は複雑性を保つ．一方，Pdzd8 cKO細胞ではFKBP8はミトコンドリアを丸くするので，ミトコンドリアは単純な形態を示す．

哺乳類細胞におけるMERCS形成機構として，今までは「Pdzd8という遺伝子がMERCS形成に必要である」，という遺伝学レベルの理解にとどまっていた．今回，著者らによって，「PDZD8はER上を動き回りつつ，ミトコンドリア上のFKBP8に捉えられ，この可逆的な結合がERとミトコンドリアをつなぎとめる」という細胞生物学レベルの理解に到達した．しかし図1で描いた簡単なモデル（単純な膜と，デフォルメされたタンパク質）は少なくとも以下の情報を捨象している．

1. 1）膜は一様ではない．膜の構造的特徴や，物理化学的特徴（膜組成，コレステロール含量，流動性や剛性など）．
2. 2）タンパク質は単純な図形では表せない．タンパク質複合体の原子レベルの構造情報，つまり，オングストロームレベルでのPDZD8–FKBP8間の結合様式や相互作用機構，ドメイン配置の情報．
3. 3）PDZD8とFKBP8はMERCS内で一様に存在しているとは限らない．オルガネラ膜に対する局在とその場でのタンパク質構造の情報．
4. 4）MERCSにはPDZD8とFKBP8だけが存在しているわけではない．他の複合体メンバーやほかの繋留複合体との関係．
5. 5）膜にかかる外力が表現されていない．外部や細胞骨格から加わる張力，浸透圧などによる機械的ストレスの情報．力場のように表現できるだろうか．

今後これらの情報を得ることで，よりミクロな視点，つまり生化学，構造生物学，生物物理学レベルで理解することが求められる．また興味深いことに，最近PDZD8がERと後期エンドソームやリソソームとの接触場にも局在することが報告された^17–19）．PDZD8がこれらMCSに関与することを踏まえると，PDZD8を介して複数のMCSが協調的に制御される可能性が浮かび上がる．このように，単なるオルガネラ間のコミュニケーションを超え，オルガネラ接触場どうしが連携することで成り立つ，より高次元的な恒常性維持の世界が垣間みえる．

本稿で紹介したPDZD8–FKBP8複合体によるMERCS形成の機能解明は培養細胞での検証にとどまっており，より生理学的な系での検証が必須である．最近，我々を含むいくつかのグループからPdzd8の生体レベルの恒常性への役割がいくつか報告され始めたところである．生理的な系でのMCSの役割の検証を通じて，生体恒常性という本質的な疑問に迫れるだけでなく，これまでMCSの異常と相関すると報告されてきたさまざまな疾患の理解にもつながると信じている．