生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

哺乳類の成体では骨の中に存在する骨髄が，血球の産生（造血）を担う重要な臓器として機能する．骨髄には最も未分化な血球である造血幹細胞（hematopoietic stem cell：HSC）が存在している．HSCは多分化能と自己複製能をあわせ持ち，一生涯にわたって血球産生をつかさどる細胞集団である．この特性から，造血器腫瘍等の根治療法である幹細胞移植や，血液・免疫疾患等の遺伝子・細胞療法に活用されている^1–3）．近年，HSCの細胞周期や分化の制御の背景には細胞内代謝制御の重要性が示されてきた．なかでもエネルギー代謝は，HSCの増殖や分化，自己複製能などさまざまな生理機能を制御する基本的なプロセスであり，正常造血・ストレス応答・老化・白血病化など，多方面の研究で大きな注目を集めてきた^4）．従来の研究から，HSCは解糖系を主体とし，ミトコンドリアの活動を抑えているというイメージが強調されていた．しかし，近年は特定のストレス環境下や加齢などの状況において，HSCがミトコンドリア酸化的リン酸化（OXPHOS）を活性化したり，あるいは逆に解糖系を大幅に強化したりと，状況に応じた多様な再編成を行うことが示唆されるようになってきた．こうした「可塑的なエネルギー代謝の切り替え」は，限られたエネルギー源を最大限活用してATPを供給し，HSCの生存や機能を維持する上で不可欠であると考えられる．これらの研究では，各種の代謝制御因子のノックアウトやスナップショットのメタボローム解析が活用されて研究が進展してきた．その一方，HSCは骨髄内に非常に低頻度で存在するため，ストレス負荷時にHSCに生じる動態変化が代謝経路をどのように変化するのか，そしてそれらが各HSCで均一に起こるのかを評価することは実験的に困難だった．しかし近年，単一細胞レベルのRNA解析やメタボローム解析などの先端技術が急速に発展したことで，希少細胞であるHSCの動態を，代謝特性の柔軟な変化を含めて細かく捉えるアプローチが次々と登場している^5–10）．我々もメタボローム解析技術を統合して運用する形で，単一細胞の生理状態を乱すことなく代謝物を定量的かつ連続的に分析する新たなアプローチを採用して研究を進めてきた．そこで本稿では，こうしたアプローチを活用して明らかにしたHSCの急性ストレス時や加齢時に生じる代謝の変化とその分子基盤についての知見を紹介しながら，そこから得られた生物学的な意義について考察したい．

まず，急性の造血ストレス下におけるHSCの代謝再編成に関する研究について紹介する．HSCは，通常は細胞周期が静止期（G0期）に存在し，低酸素環境への適応などを介してエネルギー需要を抑え，長期にわたり自己複製能を保持していると考えられてきた．自己複製時には細胞代謝は脂肪酸β酸化（FAO）とプリン代謝を活性化するように再プログラムされる^{11, 12）}．一方，急性の増殖ストレスや，ミトコンドリアの酸化的リン酸化（OXPHOS）の阻害など，ATP生成経路に大きな負荷がかかった際，HSCがどのような反応を示すのかは十分に解明されていなかった．そこで，同位体標識グルコース（U-¹³C₆-グルコース）を用いた定量的¹³Cフラックス解析と，さらに単一細胞レベルでのATP測定技術を組み合わせ，ストレス応答時の解糖／OXPHOSバランスを時系列で評価した^13）．

まず，抗がん剤5-FUを投与して分化血球を除去してHSCに増殖ストレスを誘導したマウスと，定常状態の造血を行っている対照群のマウス（PBS投与）からHSCをセルソーターで単離して，同位体標識グルコース（U-¹³C₆-グルコース）を用いてin vitro IC-MSトレーサー分析を行いグルコースの代謝フラックスを検討した．この際，体外に取り出すことによるHSCの代謝物変化を避けるため，細胞調製中はサンプルを氷上で冷やし続け，マウスの安楽死から細胞調製までの工程を可能な限り短時間で行った．5-FU投与により細胞周期が活性化されたHSCでは，嫌気的解糖への炭素フラックスが急増する一方で，TCAサイクル経路やペントースリン酸経路（PPP）へのフラックスは，増加しても限られた程度にとどまることが確認された．また，OXPHOSを阻害しても同様に解糖系が代償的に亢進し，ミトコンドリアATPを補うかたちでエネルギー産生をサポートすることも確認された．

次に，FRET型のATPバイオセンサー（GO-ATeam2）を全身で発現するマウスモデルから単離したHSCを活用し，フローサイトメーターを用いて単一HSCのATP濃度変化を秒～分スケールで記録した．本法の利点は，GO-ATeam2がレシオメトリック型センサーであることから，センサーの細胞内の発現量によるATP測定への影響が小さいこと，蛍光標識抗体による染色を組み合わせることで生きた大量かつ多種の細胞の解析が1回の実験で可能であることである．解析の結果，増殖ストレスやミトコンドリア阻害がかかった直後から秒単位で解糖系によるATP産生が急上昇し，ATPが減少しないよう制御されている様子が観察された．すなわち，増殖やOXPHOS阻害といった急性ストレスの状況下では，HSCが非常にすばやく解糖系を活性化し，ATP濃度を一定に保つ能力を有していることが示された．

この解糖系の速やかな活性化の背景にある分子機構を探索した．最終的に筆者らは解糖律速段階の反応を触媒するPFK（phosphofructokinase）を制御するPFKFB3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 3）という酵素に着目した．増殖ストレス下ではアルギニンメチル基転移酵素PRMT1依存的メチル化，OXPHOS阻害下ではAMPK依存的リン酸化，といった修飾を介して，PFKFB3の酵素活性が大きく上昇することが判明した．さらに，PFKFB3の過剰発現はHSCの増殖促進，逆にその阻害・欠損は増殖抑制をもたらし，解糖によるATP産生はPFKFB3の活性制御が鍵であると結論づけられた（図1A, B）．

図1 加齢や増殖ストレスによる造血幹細胞の代謝変化

（A）定常時の造血幹細胞（HSC）では解糖系とミトコンドリアが脱共役しており，解糖系と酸化的リン酸化（OXPHOS）のそれぞれがATPを供給しながら幹細胞性を維持している．（B）細胞増殖が開始したHSCではPFKFB3によって嫌気的解糖が加速しており，需要に応じたATP産生が進む．ミトコンドリアでのATP産生には変化はない．（C）加齢したHSCではSDHAF1によってミトコンドリアATP産生の強化がなされており，解糖系が利用できなくてもOXPHOSの複合体IIの活性を柔軟に強化することができるために生存優位性を獲得している．なお，解糖系からミトコンドリアへの代謝流束は増加傾向である．ROS：活性酸素種．

以上の結果から，HSCが急性ストレスに直面すると嫌気的解糖を大きく加速し，瞬時にATPを補うシステムを備えていることが初めて示された．PFKFB3がメチル化やリン酸化といった多層的修飾によって迅速かつ柔軟に制御されて解糖系フラックスを上げることで，ストレスが負荷されてもHSCの生存と増殖が維持されると考えられた^13）．

引き続き，急性ストレスとは対照的なHSCの加齢という慢性的変化に着目した．一般的に体内のさまざまな臓器・組織の幹細胞は加齢に伴って数が減少し，機能的にも障害されると考えられている．実際，加齢HSCは，分化能の偏りや移植時の再構築能の低下などの機能不全の側面が見いだされて研究されてきた^14）．その一方，加齢に伴って骨髄内ではHSCの数が徐々に増加していくが分子機構は不明であった．これを説明する一つのメカニズムとして，加齢に伴うHSCゲノムへの変異の蓄積とその結果生じるクローン性の増殖があげられている．しかし，ヒトでは典型的なクローン性造血変異が生じていなくてもクローン拡大はみられること，マウスでも加齢に伴いHSC数は増加するもののヒトで見いだされる典型的なクローン性造血変異は生じていないことからそれ以外のメカニズムが存在すると考えられた．そこで我々は，加齢HSCが何らかの「代謝回復力（resilience）」を後天的に獲得しているのではないかと仮説を立て，その詳細なメカニズムを探った^15）．

まず，加齢HSCが若齢のHSCに比べて数的な優位性を獲得する条件を探索した．たとえば，レシピエントマウスに移植すると骨髄への生着は加齢HSCで低下している．また，一般的な培養条件（高いサイトカイン濃度が必要）でHSCを培養すると，若齢HSCに比べて加齢HSCは培養後の幹細胞数が低く抑えられる．体外で加齢HSCが生存優位性を獲得するための条件を探ったところ，通常の培養で用いるよりも数十分の1から数百分の1の濃度，つまり生理的骨髄内に相当する濃度でサイトカインSCFとTPOを添加した培養において，若齢HSCよりもアポトーシスが少なく，むしろ生存能力に優れていることを確認した．さらに，加齢GO-ATeam2マウスからHSCを単離して単一HSCのATP濃度解析を行ったところ，加齢HSCは解糖によるATP産生を阻害してもATPレベルを大きく低下させずに維持できるなど，代謝障害に対して強い抵抗性を示すことが明らかになった．

そこでいかなる代謝変化が生じているか検討するためにU-¹³C₆-グルコースを用いたトレーサー解析を行った．すると加齢HSCは定常状態において解糖系への依存を減らし，解糖系から分岐するPPPを活性化して酸化ストレスを抑えていることが示唆された．実際，酸化ストレスを負荷した際の活性酸素上昇や生存低下の度合いは加齢HSCで抑制されていた．また，加齢したGO-ATeam2マウス由来のHSCを用いて詳細な解析を行ったところ，解糖が使えない際にはOXPHOSの複合体IIを含むミトコンドリア呼吸能力をフルに動員してATPを補完するという，柔軟な代謝シフトが可能であることが示唆された．

このOXPHOS複合体IIの活性化能の上昇の原因を探った．さまざまなメカニズムを検討した結果，加齢HSCでは，複合体II（succinate dehydrogenase：SDH）のアセンブリー因子SDHAF1の発現量が顕著に増えていることが原因の一つであると結論づけた．Sdhaf1遺伝子を若齢HSCに過剰発現させると，解糖阻害時でもミトコンドリア由来ATPが十分に維持され，まるで加齢HSCのような高い代謝学的ストレス耐性が付与される．逆に加齢HSCでCRISPR/Cas9システムを用いてSDHAF1を欠損させると，HSCの生存や静止維持に支障が出る．さらに，加齢環境（TPOシグナルなど）がSDHAF1蓄積を促していることも示唆され，加齢HSCの定常状態における代謝優位性は，SDHAF1中心の複合体II活性化に負うところが大きいとの結論に至った（図1C）^15）．

これらの結果は「加齢HSC＝すべて機能不全」という単純な図式に一石を投じるものである．もちろん移植など強い増殖刺激がかかる状況下では，加齢HSCは若齢HSCよりも劣位である．しかし，骨髄内の生理的な低サイトカイン濃度や酸化ストレスなどの厳しい条件においては，加齢HSCが後天的に身につけたミトコンドリア代謝回復力（特に複合体IIによって担われる）によって，意外にも安定的に生き延びることができる．すなわち「加齢HSCが失った能力（急激な増殖やバランスのとれた分化）もあれば，逆に獲得した能力（代謝的頑健性）もある」とみなすことができる．うがった見方をすれば，加齢HSCは本来なすべき働き（増殖や分化細胞の産生）を放棄して，自分自身の生存に全振りしている，と捉えることもできるかもしれない．この新しい視点は，加齢に伴う造血変化の複雑さを理解する上で重要である．またSDHAF1を制御することで，加齢HSCの特性を人工的に再現・改変できる可能性があり，老化関連の血液疾患や貧血などを是正するための新たな介入法として注目に値する．

上記の二つの研究が見いだしたHSCの代謝柔軟性を比較してみたい．まず共通点であるが，HSCが複数のATP産生経路を状況に応じて巧みに使い分けるという点は共通している．単一の分子（急性ストレスではPFKFB3，加齢時ではSDHAF1）で説明できる点も類似している．いずれも同位体トレーサー解析や単一細胞ATPリアルタイム観察など最先端技術を駆使してHSC代謝の可塑性を高分解能で解析して初めて見いだされた点も共通する．

一方相違点もあり，急性ストレスは増殖刺激やミトコンドリア阻害などの数時間～数日のスパンでHSCが受けるストレス応答であり，OXPHOSは活性しないまま解糖を急加速する点が主である．かつては急性ストレスが負荷されたHSCでは解糖系からTCAサイクルへの代謝流束が増大して嫌気性解糖から好気性解糖へのシフトが生じると想像されていた．実際は急性ストレスでは嫌気的解糖がただ増速してOXPHOSへの流入は変化しない点は過去の想定をアップデートするものである．一方，HSCの加齢変化は数か月以上の時間経過の結果，HSCの増殖能や分化能は低下するかわりに，定常状態におけるミトコンドリア代謝の冗長性を獲得している．ストレス応答のタイムスケールも異なり，急性ストレスではPFKFB3が速やかにメチル化やリン酸化といった多層的修飾を受け，秒単位でATP産生を確保する能力を発揮するが，加齢HSCのSDHAF1による複合体II活性向上は，解糖系が使えない状況で数分後から発動して安定したATP維持が可能になるという点で柔軟性発動のタイミングも異なる．急性ストレスは増殖などのHSCがより出会いやすい状況であるために，常に代謝柔軟性が発動しやすいように準備されている一方，加齢HSCが解糖系を使えない状況というのは骨髄内にもグルコースがそれなりに十分存在するために生じづらいためかもしれない．このように，異なるストレス条件で異なる代謝柔軟性を活用してHSCが急性と慢性のどちらのストレスにも対処できることは，「HSCという細胞集団の強靱性」を理解する上で大変興味深い．

本稿では，我々の研究を紹介して「HSCがエネルギー代謝を動的に組み替える多様なシナリオ」を概観した．こうした代謝柔軟性の理解を深めることで，HSCのストレス応答や関連病態の理解が深まることが期待される．急性ストレスや増殖不全を伴う疾患（たとえば化学療法後の造血障害など）の治療ターゲットとして，PFKFB3をはじめとする解糖系制御因子を活用することも想定される．また，老化関連の造血不全や貧血の是正，あるいはクローン性造血への介入を狙って，SDHAF1や複合体IIを標的とした創薬アプローチを検討することも今後の応用の可能性としてあげられるだろう．

さらに，これら研究で使われている単一細胞ATPモニタリング技術を含む代謝解析プラットフォームは，その時間分解能の高さと大量の細胞の解析を可能とする並列性から，HSCに限らず多様な細胞種や希少な細胞集団にも適用可能である．今回は割愛したが細胞内の代謝状態を極力維持するための培養条件の至適化が重要であるが，それを乗り越えられれば腫瘍幹細胞や組織幹細胞をはじめ，細胞数の限られた集団がどのようにストレスと闘い，エネルギーバランスを保っているのかを探る上で大きな武器となるだろう．今後の課題としては，（1）単一細胞レベルの解析で得られる詳細な代謝動態情報を，in vivoの3次元空間やより長時間のスケールへどう拡張するか，（2）HSC集団内の細胞周期状態や分化ステージ，クローン性変異などの差をどこまで厳密に切り分けられるか，といった点があげられる．それらを克服するためには，今回活用したアプローチや関連するイメージング技術のさらなる発展と組合わせ，そして生体内計測への応用が待たれる．こうした試みの先には再生医療や老化関連疾患の治療戦略に直結する知見が得られることが期待される．