生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

統合失調症は，幅広い人口集団において約100人に1人の割合で発病し，幻覚，妄想，意欲の低下等の症状を呈する精神疾患である．根本的治療が存在しないことから，生涯にわたる服薬や長期入院など発症者への重い負担が問題となっている．発症の原因について，ゲノムワイド関連解析（GWAS）等により多数の遺伝的要因が同定されており，また環境要因についても思春期における精神的ストレスなどが関与するとされるものの，各要因がどの細胞内経路において相互作用し，どのような脳部位・回路に影響を及ぼすことで症状を引き起こすのかについては明らかになっていない．その中で近年，有病者において脳や全身の炎症状態が変化しているとの報告があげられていることから，免疫・炎症関連の経路が発症や症状に関与しているのではないかという可能性が指摘されている^1）．

炎症と統合失調症とをつなぐ分子メカニズムについてもまだ明らかになっていない部分が多いが，興味深いことに，有病者では炎症関連の転写因子であるNF-κBの脳内における低下，その核内輸送を担うImportin αサブタイプの発現量の低下，および発現量を低下させる一塩基変異が増加しているとの報告が存在する^2）．今回，有病者において発現減少がみられるサブタイプであるImportin α4（遺伝子名Kpna4）の全身欠損が，マウスにおいて統合失調症様の行動異常を引き起こすことを発見した^3）．本稿では，新たに明らかとなったImportin α4の核輸送とは異なる機能が脳細胞の恒常性維持に寄与しているメカニズムの一端を解説する．

Importin α（別名Karyopherin α：KPNA）は，核局在化シグナル（nuclear localization signal：NLS）受容体として知られ，輸送運搬体Importin β1と協調してタンパク質の細胞質から核への選別輸送に機能する核輸送分子である^4）．ヒトで7種類，マウスで6種類のサブタイプが存在することがわかっており，アミノ酸配列の相同性から三つのサブファミリーに分けることができる（表1）．これらサブタイプは，それぞれが異なる基質特異性を示すことで多様な物質輸送を担っていると考えられている^5）．さらに近年，紡錘体形成，核膜重合，タンパク質分解など輸送とは異なる機能を持つ多機能分子としての側面があることもわかってきた^6）．実際，筆者たちは以前，細胞が酸化ストレスにさらされると，Importin α分子が核に局在してクロマチンと相互作用し，遺伝子発現を制御する機能を持つことを報告している^7）．しかしながら，各サブタイプがどのような機能的多様性を持っており，それがどういった局面で発揮されるかについてはいまだ不明な点が多い．

Importin α分子の生体における機能的重要性を解析するため，これまで各サブタイプに対する遺伝子ノックアウト（KO）マウスが樹立されてきた．これらKOマウスの中には，特徴的な行動異常を示す系統が複数報告されている．筆者らは以前，Importin α1（遺伝子名Kpna1）の欠損マウスがプレパルス抑制の低下，認知記憶の障害など統合失調症様の行動異常を示すことを報告した^8）．統合失調症では幼少期における心理的ストレスなどの環境因子が発症に寄与することが知られていることから，ヒトの思春期に相当する5～8週齢の間に個別飼育することで社会的孤立状態を負荷した．その結果，抑制性回避試験における嫌悪記憶，プレパルス抑制テストにおける感覚運動ゲーティング，強制水泳試験における無動の指標が悪化するなど，表現型の有意な増悪が観察された^8）．さらに，環境因子への感受性が高い幼少期のImportin α1欠損マウスに向精神薬フェンシクリジンを投与すると，側坐核において統合失調症に特徴的な遺伝子発現の変動がみられた^9）．これらのことから，Importin α1を欠損したKOマウスでは，ストレスなどの環境要因に影響されて脳の機能破綻が進行することが明らかとなった．統合失調症患者を対象とした大規模遺伝子研究において，ヒトのKPNA1遺伝子の変異が関わる可能性が指摘されている^10）．このことから，本マウスは，統合失調症の特徴である遺伝要因と環境要因の累積的な効果（G×E交互作用）を解析するモデルマウスとなると考えられる．

また，別のサブタイプであるImportin α3（遺伝子名Kpna3）のKOマウスでは，報酬欲求行動の増加を示すことも明らかとなった^11）．解析の結果，KOマウスの脳では脳領域間ネットワークの変化がみられるなど脳の意欲抑制機構の破綻が生じている可能性がわかってきた．ヒトの研究から，KPNA3遺伝子の一塩基多型（SNP）が，統合失調症やアルコール依存症，薬物依存症など，意欲や報酬行動の異常を伴う精神疾患と関連していることが示されていることから^12），本分子に特異的な機能がこれら精神疾患の発症機序解明に重要な知見となるかもしれない．

そして最近，筆者らは，Importin α4（遺伝子名Kpna4）のKOマウスが，不安水準の上昇，恐怖記憶の低下，社会性の低下，プレパルス抑制の低下等，ヒトの統合失調症でみられる症状に類似した行動異常を示すことを発見した^3）．Importin α4はImportin α3と同じサブファミリーに分類され基質特異性も近いにもかかわらず，両者の表現型がまったく異なる点は興味深い．また，Importin α1 KOマウスと異なり遺伝要因のみで顕著な症状を呈する点も特徴である．このようなKOマウスごとでの表現型の違いは，各サブタイプが独自に持つ機能特性に起因するものと考えられるが，各Importin α分子のどのような機能がマウスの行動異常に関わっているかは不明であった．そこで，Importin α4欠損で生じる行動異常の分子メカニズムについて，詳細に解析した．

まず，Importin α4 KOマウスの脳を領域別に分けて採取し，遺伝子発現を定量した．その結果，Tnf-α, Il-1β, Il-6といった典型的な炎症性サイトカイン遺伝子の発現が上昇傾向にあり，特に前頭葉や扁桃体においては有意に発現上昇していることを見いだした．炎症性サイトカインの発現に関与するシグナル伝達分子NF-κBのp65（RelA）やp50分子は，Importin α4に認識され核へと輸送されることが知られている^5）．そこで，KOマウスより脳内の炎症反応に関与するアストロサイトを初代培養し，p65の細胞内局在を調べた．その結果，野生型（WT）細胞と同様にKO細胞においても，TNF-α刺激に依存してp65は核に移行した（図1A）．このことは，Importin α4欠損細胞では，他のImportin αファミリー分子がp65を核へと輸送していることを意味している（図1D）．実際，Importin α4によって輸送されることが知られている複数の核タンパク質の細胞内局在を検証したところ，検討したすべての輸送基質がKO細胞において核に局在していた．このことから，たとえImportin α4を欠損したとしても，核輸送機構自体はおおむね正常に保持され機能していることがわかった．

図1 Importin α4欠損マウス由来グリア細胞における炎症性サイトカインの発現上昇

（A）野生型マウス由来グリア細胞およびImportin α4（Imp-α4）欠損グリア細胞をTNF-α処理した際のNF-κB p65の核局在を免疫染色で示したもの．欠損グリア細胞においてもp65が核内に輸送されることがわかる．（B）Aでの核および細胞質におけるp65の蛍光強度を比較したグラフ．Imp-α4欠損グリア細胞の方が高いp65核局在を示す．（C）野生型グリア細胞およびImp-α4欠損グリア細胞における炎症性サイトカイン（Il-1β, Il-6）mRNAの発現相対比率．欠損グリアでは刺激に応じて有意に高い炎症性サイトカイン発現を示す．（D）Importin α4（α4）とImportin β1（β）によるNF-κB p65/p50の細胞質から核への輸送を示した模式図．左図：野生型細胞．右図：Importin α4欠損細胞．欠損細胞では，別のImportin αサブタイプ（α）がp65/p50の核輸送を代替する．（A～C）文献3より図を改変した．

一方で，p65の核集積度を調べたところ，WT細胞と比べKO細胞の方が有意に高かった（図1B）．さらに，Il-1βやIl-6の発現もKO細胞において有意に上昇していた（図1C）．これらの結果から，KO脳細胞における炎症性サイトカインの発現上昇は，Importin α4の核輸送とは異なる機能の不全が関与していることが示唆された．

我々は以前，Importin α4が核輸送だけでなく遺伝子発現制御機能を発揮し得ることを見いだしている^7）．そこで，Importin α4欠損による炎症性サイトカインの発現上昇が，遺伝子発現制御機能によるものかを検証するため，遺伝子レスキュー実験を行った．まず，KOマウスから樹立したマウス線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast：MEF）に，Importin α4の全長遺伝子，およびImportin β結合（Importin β binding：IBB）領域を欠いた核輸送不全変異体（ΔIBB）遺伝子を強制発現させ，炎症性サイトカインの発現を抑制するかどうかを検証した．その結果，Importin α4全長遺伝子と同様，ΔIBB変異体遺伝子を発現した細胞でも炎症性サイトカインの発現が抑制された．このことから，Importin α4は核輸送機能よりむしろ遺伝子発現制御機能を発揮することで炎症性サイトカインの発現制御を行っていることが示唆された^3）．

最後に，Importin α4の欠損によって，脳内の炎症反応および炎症性サイトカインの分泌に関与するグリア細胞（ミクログリア，アストロサイト）の遺伝子発現にどのような影響があるかを検証した．KOマウスの脳組織からグリア細胞を選択的に回収し，RNAシーケンス（RNA-seq）により遺伝子発現の変化を調べた（図2A）．さらに，RNA-seqにより得られた遺伝子発現パターンに基づいて，「発現が変化した遺伝子を制御している転写制御因子」を，エンリッチメント解析（図2B）およびwPGSA解析^13）（図2C）により探索した．その結果，KOマウス由来のミクログリアにおいて，特に発現が減少した遺伝子の多くが，ヒストンH3の27番リシン残基（H3K27）をトリメチル化するPolycomb repressor complex 2（PRC2）構成因子群（EZH2, SUZ12, JARID2，等）の制御対象であると予測された．PRC2によるH3K27トリメチル化は近傍遺伝子の転写抑制に関与することが広く知られており，KOマウスのグリア細胞内で起きている遺伝子発現の変化は，PRC2による転写抑制機能が関与していることを示唆する結果となった．先行研究において，PRC2の機能亢進によりミクログリアが炎症反応を起こすという報告が存在することから^14），正常時において，Importin α4はPRC2の機能を抑制的に制御している可能性が示唆された．以上のことから，マウスの行動制御や脳細胞の恒常性維持にImportin α4の遺伝子発現制御機能が重要な役割を担っていることが明らかとなった（図3）．

図2 Importin α4欠損マウス由来グリア細胞におけるPRC2による転写抑制の亢進

（A）Imp-α4欠損ミクログリアにおいて変動した遺伝子．（B）Imp-α4欠損ミクログリアにおいて発現が減少した遺伝子に対するエンリッチメント解析．（C）Imp-α4欠損ミクログリアの遺伝子発現パターンに対するwPGSA解析（各転写因子の発現への寄与度予測）．文献3より図を改変した．

図3 Importin α4欠損マウスが示す統合失調症様の行動異常発症メカニズムの概念図

野生型マウスの脳細胞では，Importin α4（α4）はImportin β1（β）と協調してNLSを持つタンパク質の核への輸送に機能する．さらに，核内において遺伝子発現制御機能，特にPRC2（SUZ12, EZH2, EEDなど）に対する抑制機能を発揮している．Importin α4欠損脳細胞では，核輸送機構自体は大きく影響を受けない．これは他のImportin αサブタイプがImportin α4の輸送機能を補っているためと考えられる．一方，核内においては，PRC2抑制機能が発揮されないため，異常なクロマチンの変化および炎症性サイトカインの発現亢進が惹起され，結果として脳内炎症に起因した統合失調症様の行動異常につながると考えられる．

今回の研究は，Importin αが持つ「核輸送とは異なる機能」がマウスの行動に大きく寄与する可能性を示した初めての例である．特に，Importin α4が脳内炎症と統合失調症とをつなぐ分子の一つとして機能していることを示唆した点は意義深い．加えて，有病者において炎症反応が亢進しているとする統合失調症の炎症仮説^15）を支持する結果であるとも考えられる．一方で，本研究結果は，有病者の死後脳におけるKPNA4遺伝子の発現減少ならびにNF-κB下流遺伝子の発現量低下を示した先行研究^2）とは必ずしも一致しないことから，ヒトとマウスの疾患発症機序についてさらに解析が必要である．精神疾患研究におけるImportin α分子ファミリーの機能的関与の解明は始まったばかりであるが，本分子群の機能特性解明を基軸に，精神疾患に対する新たな治療への道が開けることを期待したい．