生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

ゴルジ体は，シス槽，メディアル槽，トランス槽といった複数の膜区画からなり，糖鎖修飾や細胞内物質輸送（膜交通）システムの中核として働く重要なオルガネラである^{1, 2）}．小胞体で新規合成された膜・分泌タンパク質（積荷）は，小胞体上のER exit site（ERES）から積み出された後，小胞体–ゴルジ中間区画（ER-Golgi intermediate compartment：ERGIC）を経由してゴルジ体のシス槽に取り込まれる．その後積荷はメディアル槽，トランス槽へと順に移動しながら適切な修飾を施され，トランス槽のさらに外側に存在するトランスゴルジ網（trans-Golgi network：TGN）と呼ばれる区画へと受け渡される．TGNでは積荷が選別され，輸送キャリアに積み込まれて，それぞれの積荷が機能を発揮するべき細胞内外の目的地（細胞膜，エンドソーム，リソソーム／液胞，細胞外空間など）へ向けて搬出される．

複数の槽からなるゴルジ体を積荷がどのように通過してゆくのか？という問いに対して，古くから「小胞輸送モデル」と「槽成熟モデル」という二つの仮説が提唱されていた．小胞輸送モデルでは，槽は安定的な区画として存在し，積荷が小さな輸送小胞に搭載されてシス槽からメディアル槽，トランス槽へと順行性に輸送される．一方の槽成熟モデルでは，積荷を搭載したシス槽が，積荷を保持したまま，メディアル槽，トランス槽へとその性質を徐々に変えてゆく．この槽の性質変化（槽成熟）のためには，各槽のアイデンティティを決定づける糖転移酵素などの常在タンパク質群がCOPI被覆小胞に搭載されて，メディアル槽→シス槽，トランス槽→メディアル槽といったように，逆行性に輸送されることになる．

二つのモデルのどちらが正しいのか，従来の遺伝学・生化学的手法では決定的な証拠が得られず，長く論争が続いた．この状況を打破すべく，我々の研究室では，高速超解像顕微鏡法（super-resolution confocal live imaging microscopy：SCLIM）^{3, 4）}を自ら開発し，ゴルジ体の槽成熟モデルが正しいことを証明する最初のデータを報告した^3）．2006年のこの研究では，出芽酵母細胞を実験材料として，生きた細胞内でSed5（シス槽マーカー）とSec7（TGNマーカー）をそれぞれ緑色と赤色の蛍光タンパク質で二重標識し，SCLIMで経時観察した．ゴルジ槽間を往来する輸送小胞は直径100 nm以下と非常に小さく追跡が困難だが，直径1 µm程度のゴルジ槽については時空間動態を詳細に観察することが可能である．小胞輸送モデルが正しければ，蛍光標識された槽の色（赤／緑）は長時間変化しないはずである．しかしSCLIM観察では，最初に赤色を発していた一つの槽が徐々に緑色へと変化してゆく様子がはっきりと捉えられた．この色の変化は，観察された槽が当初保持していたSed5分子を徐々に放出しながら，それに相補するようにSec7分子を取り込んだことを示しており，槽成熟が本当に起きていることを示す決定的な証拠となった．本発見の重要な鍵の一つは，実験材料として出芽酵母細胞を用いたことにある．脊椎動物や植物細胞のゴルジ体は，多数の槽が隣接して積み重なったスタック構造をとるため，単独の槽で色の変化の有無を判定することは，超解像顕微鏡の分解能でも困難である．一方，酵母細胞のゴルジ体はスタック構造をとらず，各槽が孤立して散在するため，色の変化を追跡することができたのである．

この最初の報告を皮切りに，多くの研究グループが次々に酵母ゴルジ体のライブイメージングに参入し，現在ではゴルジ体とその周辺オルガネラに存在する50種類以上もの機能タンパク質の挙動が明らかになっている．これら分子群の槽成熟に沿った出現・消失のタイミングを時系列にマッピングし，我々は，酵母ゴルジ体における槽成熟過程を以下の機能ステージに分類した（図1）^{5, 6）}．（1）ERGIC：小胞体–ゴルジ体の輸送，（2）シス／メディアル槽：糖鎖合成，（3）トランス槽：TGN形成の足場，（4）前期TGN：TGNへの積荷搬入，（5）後期TGN：TGNからの積荷搬出．槽成熟は漸進的な過程なので，前後に隣り合うステージ間に明確な境界線を引くことは難しいが，各ステージに機能的定義を割り当てることは，ゴルジ体を中心としたさまざまな膜交通経路を解明する上できわめて重要である．本稿では，我々の一連の研究成果^3–10）を中心に，各ステージに関する現在までの知見を詳しく説明する．

図1 酵母ゴルジ体槽成熟の時間マッピング（文献5より引用）

25種類のERGIC／ゴルジ体／TGN常在分子をSCLIMで観察し，その出現期間をゴルジ体成熟の時間軸上にプロットした．これに基づいて，ゴルジ体槽成熟の機能ステージを定義した（ERGIC/GECCO，ゴルジ体シス槽，ゴルジ体メディアル槽，ゴルジ体トランス槽，前期TGN，後期TGN）．

ゴルジ体槽成熟の開始点であるシス槽はどのように形成されるのだろうか？　脊椎動物においては，小胞体–ゴルジ体間の積荷輸送を中継する区画として，ERGICと呼ばれるオルガネラが同定されている．他の生物種と異なり，脊椎動物のゴルジ体は核近傍の1か所に集積し，ゴルジリボンと呼ばれる巨大構造をとる．このため，細胞辺縁部に多数存在するERESからの積荷輸送の距離は長く，ERGICは当初，この長距離輸送を中継するための脊椎動物に特異的なオルガネラとして同定された．一方，ゴルジ体が細胞質に多数散在する酵母や植物細胞においては，ERGICの存在は想定されていなかった．ERGICのマーカーとしては，ERGIC53やRab1といった，小胞体–ゴルジ間輸送を担う機能タンパク質があげられる．我々は，酵母細胞におけるこれらの相同因子（それぞれEmp46とYpt1）の動態をSCLIM観察した^5）．Emp46とYpt1は，ゴルジ体と同程度の数とサイズ（直径1 µm程度）の区画に集積して細胞内を動き回っていた．ゴルジ体シス槽のマーカー（Mnn9）とEmp46を二重標識すると，一部の区画で両者は共局在したが，単独区画も存在していた．そのうちのEmp46単独陽性区画を経時観察すると，時間経過とともにMnn9のシグナルが現れ，徐々にそのシグナルが強くなるとともにEmp46のシグナルが減少し，最終的にはMnn9単独陽性区画へと変わった（図2）．すなわち，酵母においても脊椎動物のERGICと相同な区画が存在しうることが判明し，さらにそのERGICが成熟することでゴルジ体シス槽が生まれることが明らかになったのである．また，成熟途中の槽の内部をSCLIMで詳細に観察した結果，ERGICマーカー（Emp46）とシス槽マーカー（Mnn9）は，互いに混ざり合うことなく，一つの槽内で区画化された状態で共存している例がしばしば観察された．

図2 SCLIMで観察された酵母細胞のERGICからゴルジ体への槽成熟（文献5より引用）

（A）EGFP標識のERGICマーカーEmp46（緑）とmCherry標識のゴルジ体シス槽マーカーMnn9（マゼンタ）を酵母細胞に共発現させ，二色同時に撮影した．白点線は細胞の輪郭．（B）（A）の白矢印で指した槽の経時変化像．撮像開始時にEmp46（緑）で標識されていた槽が，時間経過とともにMnn9陽性画分（マゼンタ）へと遷り変わった．（C）（B）の水色枠の拡大像．成熟途中の槽内では緑とマゼンタのシグナルが完全にはオーバーラップせず，異なる空間的分布を呈していた．（D）（C）の点線矢印に沿った蛍光強度のラインプロファイル．

酵母においてERGIC相当区画が発見されたことで，ERGICは脊椎動物に特異的なER–ゴルジ間輸送の中継点というよりも，輸送距離にかかわらず，積荷の受取りに特化したゴルジ体シス槽の前駆体として再定義するべきと我々は考える．植物細胞や昆虫細胞においては，ゴルジ体がリボン構造をとらず，スタック構造が一単位となって細胞質中に多数散在するが，個々のゴルジスタックは小胞体上のERESと接触した状態で存在するため，従来の脊椎動物ERGICの定義に該当する区画は存在しない．しかし我々は以前，植物細胞のゴルジスタックの最シス槽（小胞体に接した区画）が，積荷の受取りに特化した，シス槽とは機能的に異なる区画であることを明らかにし，これをGECCO（Golgi entry core compartment）と名づけた^{11, 12）}．このGECCOの機能は，まさにこの新しいERGICの定義に合致する．生物種によりゴルジ体の細胞内分布は大きく異なるが，機能的観点からは，ゴルジ体が担う積荷輸送の分子機構が生物進化の過程で高度に保存されてきたことが強く示唆される．

ゴルジ体の主な機能は積荷分子への糖鎖付加である．多くの糖鎖修飾関連分子の動態が可視化解析されている．一例として，Mnn9（マンノース転移酵素）やVrg4（マンノーストランスポーター）はシス槽マーカーとして頻用されているが，前述のようにこれらはERGIC常在分子に遅れて出現する．また，Mnn2はMnn9よりも後に出現するが，これはMnn2がN型糖鎖合成経路においてMnn9より後に働くという事実と一致する．糖鎖合成には多くの糖転移酵素群が順序よく働く必要があり，槽成熟過程で酵素群が適切な場所とタイミングで出現することで，積荷タンパク質との会合が巧妙に調節されていると考えられる．槽内で使い終わった糖転移酵素は，COPI被覆小胞に乗ってより早いステージの槽に戻され再利用される．SCLIM観察では，COPIサブユニットSec21は，シス槽マーカーMnn9とほぼ同じタイミングで出現し，その後トランス槽マーカーであるSys1の消失と同じタイミングで消失した．すなわちCOPI小胞はシスからトランス槽にわたって継続的に産生されており，このことはCOPIが多種類の糖転移酵素の逆行輸送に寄与するというモデルに合致する．

槽成熟の概念に基づけば，ゴルジ体成熟の最終段階はTGN形成の足場としても働くはずである．我々は，この足場機能をトランス槽の新しい定義の一つとして焦点を当てたい．詳細は後述するが，TGNは新規合成された積荷だけでなく，エンドサイトーシスされた積荷も取り込む．golginファミリータンパク質Imh1は，エンドサイトーシスされた積荷を含む膜区画を捕捉するための係留因子として働く．Imh1をゴルジ膜上にリクルートするための因子として，Sys1, Gea2, Ypt6などの分子が同定されている．これらの分子群が，トランス槽およびトランス槽からTGNへの移行過程において出現することが示されている．

TGNは糖鎖付加を受けた積荷の選別と搬出を行う区画として定義できる．TGNのもう一つの重要な役割は，エンドサイトーシス経路からの積荷の取り込みである．前述のように，ゴルジ体トランス槽には係留因子Imh1が存在し，TGN形成の足場として機能している．エンドサイトーシス経路からの輸送小胞は，Imh1に係留された後，SNAREタンパク質Tlg2によってゴルジ膜と融合する（図3）．Tlg2とSys1（トランス槽マーカー）の動態を比較したところ，Tlg2はSys1に遅れて現れることがわかった^6）．ここでも，Sys1からTlg2への移行時は，二つの領域はしばしば空間的に分離していた．Tlg2シグナルに続いて，積荷の搬出を担うClc1（クラスリン軽鎖）が現れたことから，TGNへの積荷搬入と搬出は順序立って起こることが示唆された．ここでもまた，Tlg2-Clc1移行中の槽内では，二つの領域がしばしば分離していた．さらに，エンドサイトーシス経路からの積荷がTlg2陽性区画に取り込まれることも判明している^13）．これらの観察により，TGNは二つのサブステージ，すなわち，Tlg2を代表的マーカーとして積荷の搬入を担う前期TGNと，Clc1を代表的マーカーとして積荷の搬出を担う後期TGNに分類できると考えられる．

図3 酵母ゴルジ体のトランス槽からTGNへの移行（筆者らのモデル）

ゴルジ体のトランス槽には，係留因子Imh1や，Imh1をリクルートするための因子Sys1が存在し，前期TGN形成の足場として機能する．エンドサイトーシス経路からの輸送小胞は，トランス槽においてImh1に係留された後，前期TGNにおいてSNAREタンパク質Tlg2によって膜融合し槽内に取り込まれる．その後前期TGNは，GGAやAP-1が媒介する積荷搬出ステージである後期TGNへとさらに成熟する．

前述のように，後期TGNは積荷搬出ステージとして定義できる．TGNからの積荷搬出に働くArf-GEFであるSec7は，Tlg2より後に現れ，その寿命はクラスリンやGga1, Gga2, Apl2, Ent3, Ent5を含むさまざまなクラスリンアダプタータンパク質の出現時間帯をカバーする．出芽酵母ではGGA（Gga1とGga2）がTGNからPVC（pre-vacuolar compartment）への輸送を媒介している．またAP-1複合体（Apl2）は，TGNからゴルジ体に戻るゴルジ体常在タンパク質のリサイクルに関与することが最近示された．後期TGNにおけるクラスリン出現時間の前半にはGga1/Gga2が，後半にはApl2が出現する^6）．このような，さまざまなコート／アダプタータンパク質の異なる出現パターンは，目的地ごとに積荷を効率的に輸送キャリアに搭載するために役立っているものと思われる．

本稿で概説したように，ライブイメージング技術の進歩により，多種多様な機能タンパク質が入れ代わり立ち代わり一つの槽に出入りする，ゴルジ体槽成熟の詳細なダイナミクスが明らかになってきた（図1）．本稿ではふれなかったが，我々は積荷の可視化にも成功しており，小胞体からゴルジ体への積荷の受け渡しや，ゴルジ槽成熟過程における積荷分子の動態も明らかになっている^{7, 8）}．今後，さらに多くの機能タンパク質が次々に可視化され，槽成熟の時空間マップに追加されてゆくであろう．

最近我々は，時空間分解能を大幅に向上させた次世代型SCLIM（SCLIM2M）を開発した^14）．SCLIM2Mは，イメージインテンシファイアと超高速CMOSカメラ（1000フレーム／秒）を組み合わせることで，蛍光分子から放出される単一光子由来のシグナルを個別に検出し，新規開発した画像再構築アルゴリズムを適用することで，100 nm以下の空間分解能を実現した．また，高速ピエゾを用いることで，高速（20 volumes/s）で連続3D画像を取得することができる．近い将来，SCLIM2Mにより，槽を出入りする直径100 nm以下の輸送小胞の追跡が可能になり，槽成熟機構の理解がさらに大きく進むことが予想される．