生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

これまで，遺伝子機能を明らかにする逆遺伝学的手法は，遺伝子ノックアウトやRNAノックダウンなど，DNAやRNAを標的にしたものが主流であった．しかし，近年は直接標的タンパク質を分解するプロテインノックダウンがその迅速性から注目されている．本稿ではプロテインノックダウンの中でも，分解誘導タグ（デグロン）と分解誘導リガンドを利用したオーキシンデグロン法に代表されるコンディショナルデグロンに焦点をおく．さらにごく最近，筆者らが報告した，異なるデグロン技術を組み合わせた技術拡張法，そしてその応用例について紹介する．

細胞内におけるタンパク質の機能を解析するには，それを欠失させた際にどのような影響が生じるのかを観察する逆遺伝学的手法が頻繁に利用される．遺伝子ノックアウト法は非常に効果的であるが，標的タンパク質が生存に必須な場合，そもそも遺伝子欠損細胞を樹立することは不可能である．さらに，遺伝子欠損細胞の樹立過程において，代替経路による補償が働き，表現型が表出しない可能性も考えられる．これらの問題を回避するために，Cre-loxP, Tet-On/Offによる遺伝子発現制御，またはsi/shRNAを用いた標的RNA分解などの，コンディショナル発現制御技術が用いられてきた．しかしこれらの手法はDNAやRNAレベルにおいて遺伝子発現を遮断するため，標的タンパク質自体の除去にはその半減期に依存した時間を要する．一般には十分なタンパク質除去に至るまで1～2日程度必要であり，その間に標的タンパク質の発現量低下に伴う二次的影響の蓄積が懸念されることがある．これらの問題は，迅速に標的タンパク質を除去し，直後に生じる影響を解析することで回避できる．コンディショナルデグロンは標的タンパク質を迅速分解することで，除去直後の直接的な影響の観察を可能にする．

タンパク質を標的としたコンディショナル発現制御として，最も古いものはファージ，大腸菌，酵母の温度感受性変異体である．標的遺伝子に導入された変異により，制限温度においてタンパク質構造が不安定になり，機能不活性化や分解が引き起こされる．その後，出芽酵母においては，高温条件で不安定化するペプチドをデグロンとして標的タンパク質に付加し，融合タンパク質を温度制御により分解する温度感受性デグロン法が開発され，細胞周期・DNA複製研究などで大いに活用された^1）．しかし，この手法は標的タンパク質の分解誘導に温度変化を必要とするため，許容温度範囲の狭い哺乳類細胞には適用が困難であった．そこで，温度制御に代わり，化合物により分解を制御する技術が開発された．

1）不安定性デグロン

DD（destabilizing domain）やSMAShと呼ばれる技術は，構造の不安定性により常時分解誘導されるデグロンをベースに，リガンド結合によるデグロン構造の安定化や，リガンド依存的に不活性化する自己切断プロテアーゼを併用したデグロンの着脱によって，リガンド依存的な標的タンパク質分解制御を行う（図1）^{2, 3）}．一方で，デグロン自体に本来不安定性はないが，リガンド依存的にE3ユビキチンリガーゼがデグロンを認識し，ユビキチン化により分解誘導する技術が，以下に紹介するオーキシンデグロン（auxin-inducible degron：AID）法や，dTAGをはじめとしたPROTAC基盤デグロン法である．

図1 主要なコンディショナルデグロン技術一覧

不安定性デグロンを用いた手法と，デグロンと低分子化合物の相互作用を利用し，直接ユビキチン化を誘導して分解に導く方法に大別される．不安定性デグロンは，オーキシンデグロンやPROTAC基盤デグロンのように明確な分解経路は判明していないが，主にユビキチン・プロテアソーム経路にて分解されることが知られている．

2）オーキシンデグロン（AID）法の開発と改良

AID法は，植物が有するオーキシン（インドール酢酸，IAA）による遺伝子発現制御系を非植物細胞に導入することにより開発された^{4, 5）}．植物はIAA依存的にオーキシン受容体TIR1を介してSCF型E3ユビキチンリガーゼを活性化することで，転写抑制因子AUX/IAAをユビキチン化・分解誘導し，オーキシン応答遺伝子を発現させる^5）．AID法では，AUX/IAAのTIR1結合部位をデグロン［mini-AID（mAID）、AID*等］として標的タンパク質に付加する．そこへイネ由来のTIR1（OsTIR1）を細胞に発現させると，OsTIR1はその細胞が持つSCF型E3ユビキチンリガーゼサブユニットと機能的な複合体を形成する．この状況において，IAAを添加すると標的融合タンパク質の速やかなユビキチン化・分解を誘導できる（図1）．しかし，当初のAID法では，100～500 µMという高濃度のIAAが必要であったこと，IAA非添加時にも標的タンパク質が定常的に弱い分解を受けてしまうことなどの課題が存在した．そこで我々はOsTIR1の変異型（F74G）と，それに特異的に結合するIAA誘導体5-Ph-IAAを組合わせて利用することで，これら二つの課題を解決できることを明らかにし，改良AID（AID2）法として報告した^6）．類似の方法は他グループからも報告されている^7）．AID2法は1 µM以下の低濃度リガンドで，従来のAID法よりもさらに迅速かつシャープな分解を実現できるだけでなく，マウス個体や線虫にも適用できることが実証された^{6, 8）}．AID2法の利用にはOsTIR1（F74G）の発現を必要とするが，その発現に組織特異的プロモーターなどを利用すれば，特定の組織のみで標的タンパク質分解を誘導することも可能である^{9, 10）}．

3）PROTAC基盤デグロン

標的タンパク質とE3ユビキチンリガーゼのそれぞれに結合する小分子をリンカーでつないだヘテロ二機能性の化合物により，標的タンパク質のユビキチン化・分解を誘導するプロテインノックダウン技術はPROTACと呼ばれる．基礎研究における汎用性を目的に，特定のデグロンタグに結合するPROTACとして開発された方法がPROTAC基盤デグロンである（図1）．有名なものはラパマイシン誘導体との強い相互作用が知られるFKBP12（F36V）をデグロンとして利用するdTAG法である^11）．dTAG法のPROTACリガンドには，それぞれ異なるE3リガーゼを利用するdTAG-13とdTAG v-1の2種類がある．近年さらに，BRD4のブロモドメイン変異体を新たなデグロンとして利用したBromoTag法が開発された^12）．他にも，HaloTagと，その特異的な共有結合リガンドを利用したHalo-PROTACなどが報告されている^13）．PROTAC基盤デグロンは，内在性E3リガーゼを利用するため，AID法のようにE3リガーゼ遺伝子を導入する必要がないという利便性がある反面，PROTACリガンドが結合するE3リガーゼが発現していない細胞や生物種では利用できない．

1）AID2の課題と解決策

AID2法はその実用性の高さから，多くの研究ですでに活用されている．しかし筆者らは，一部のタンパク質では，AID2による分解では表現型を得るのに不十分なケースがあることに気がついた．この原因は標的タンパク質の特性（発現量，局在，立体構造，機能に必要な分子量等）によりさまざまであると考えられ，個々の原因に特化するよりも，幅広く分解強化が期待できる解決策が求められた．そこで筆者らは，AID2とPROTAC基盤デグロンの組合わせによりこの課題を克服できることを報告したため，以下で紹介する^14）．

2）AID2とPROTAC基盤デグロンの比較

AID2法とどのPROTAC基盤デグロンを組み合わせるのが適切かを知るため，筆者らはヒト培養細胞株HCT116とhTERT-RPE1において各種デグロンを付加したGFPレポーターシステムを構築し，AID2とPROTAC基盤デグロン（dTAG-13, dTAG v-1, BromoTag）の分解効率を比較した．結果，dTAG v-1とBromoTagはAID2に近い効率的なGFP分解を誘導したが，dTAG-13はHCT116では分解効率が低いことが判明した．これは，HCT116においてdTAG-13に必要なE3リガーゼの内在性発現量が低いことが原因だと考えられる．コンディショナルデグロンは本来可逆的であるべきだが，分解後の標的タンパク質の再発現を評価する実験においてdTAG v-1では除去後の発現回復が悪いことを加味し，筆者らはAID2との組合わせにBromoTagを採用することとした．

3）AID2とBromoTagによる独立分解誘導法

ここで，AID2とBromoTagは異なるリガンドとE3ユビキチンリガーゼを利用するため，2種の標的タンパク質に別々に適用すれば，一つの細胞株で独立して分解を制御できることが期待された．実際に，AID2とBromoTagで二つの異なる内在性タンパク質を標的にした細胞株を樹立した結果，リガンドの使い分けにより2種の標的タンパク質の分解誘導を完全に独立して制御できることが確かめられた（図2上）．これにより，2種のタンパク質を片方または両方除去した際の影響を同一の細胞株条件で比較できるだけでなく，除去の時期をずらした解析などが可能で，実験の幅が広がる．

図2 AID2とBromoTagを組み合わせた技術拡張法

（上）AID2とBromoTagを2種の標的タンパク質に別々に適用すると，独立した分解が誘導できる．グラフは，染色体構造維持に重要な内在性コヒーシン構成因子RAD21にmAIDと緑色蛍光mCloverを付加し，内在性コンデンシン構成因子SMC2にBromoTagと赤色蛍光mCherry2を付加した細胞株を各リガンド条件で2時間処理した際のFACSによる定量結果である（n＝3, ±S.D.）．（下）AID2とBromoTagの二つのデグロンを直列につなぐと，標的タンパク質分解を強化できる．内在性ORC1に付加した際のORC1の各リガンド処理時間における分解を抗ORC1抗体でウェスタンブロットにて評価した．各リガンド条件において，0分を基準とした際の240分処理時の定量値の割合を最終分解率として示した．（文献14より改変）

4）AID2とBromoTagを融合したダブルデグロン法

筆者らは，AID2とBromoTagデグロンを直列につないだダブルデグロンを一つの標的タンパク質に適用すれば，双方のユビキチン化経路を利用し，より強力に標的タンパク質を分解できると予想した．そこで，単一のデグロンでは分解が不十分であった，DNA複製因子ORC1にダブルデグロンを適用したところ，両方のリガンドの同時添加で，より迅速かつ強力にORC1を分解できることが示された（図2下）．これまでヒト細胞におけるORC1の必須性は疑問視されており，単一のデグロンでは結論に至れなかったが，本ダブルデグロンによる強力分解後に細胞は増殖を停止したため，その必須性の証明に成功した．本ダブルデグロン法を用いた分解強化と表現型の顕在化はほかのDNA複製因子を標的にしても確かめられたため，広く適用可能な技術であると期待できる．AID2とBromoTagの組合わせのほかに，AIDとSMAShでの分解強化を報告した例もあり^15），今後目的タンパク質や細胞株等に応じて組合わせを最適化できれば興味深い．

ダブルデグロン法は分解を強化できるが，それでもわずかに標的タンパク質が残留する場合があることに留意したい．たとえば，ORC1の強力分解によりDNA複製は抑制され，細胞はS期でDNA複製が完了できずに増殖を止めるが，わずかに残存するORC1により，DNA複製の開始自体を完全に止めることはできない．そこで筆者らは，ORC1と同一の経路に寄与するDNA複製因子CDC6にもダブルデグロンを付加し，ORC1とCDC6双方を同時に強力分解除去したところ，ヒトHCT116細胞のDNA複製の開始を完全に抑制することに成功した（図3A, B）．興味深いことに，この際ほとんどの細胞は，DNA複製が生じていないにもかかわらずCDK依存的に細胞周期を進行させ，最終的に姉妹染色分体を持たない分裂期まで進行した（図3B, C）．これにより，細胞周期のG1から分裂期までの進行において，DNA複製を分離できることが示された^14）．本細胞株はDNA複製と細胞周期進行を完全に切り離すことが可能な前例のないヒト培養細胞株である．これはDNA複製や細胞周期研究のみならず，染色体研究などにも貢献できる材料であると期待される．このように，ダブルデグロンによる強力分解を同一経路上の複数の因子に同時に適用すれば，目的とする生物学的経路の時期特異的かつ完全な遮断を実現できる可能性がある．

図3 ダブルデグロン法によるヒトDNA複製の完全阻害

（A）真核生物におけるDNA複製開始の分子メカニズム．（B）内在性ORC1とCDC6の双方にダブルデグロンを付加した細胞株による解析．2種類のリガンドで同時に24時間処理すると，DNA複製は完全に抑制されたが，多くの細胞は分裂期マーカー陽性の分裂期形態を示していた．この時細胞は姉妹染色分体を持たない単一の染色分体を形成する．（文献14より改変）（C）DNA複製を完全に阻害すると，細胞は複製なしの細胞周期を進行させ，二倍体のまま分裂期に入る．

本稿では，目的タンパク質の機能解析に利用されるコンディショナルデグロン技術についてそれぞれの特徴や違いについて議論した．すべての要望に沿う万能なデグロン法は存在しないため，個人の研究目的に合わせた手法の選択が重要である．後半では，異なるデグロン法を併用することにより，2種の標的タンパク質の独立分解制御や，ダブルデグロン法による分解効率強化が可能であるという，技術拡張性について紹介した．これにより，従来実現できなかったレベルでの綿密な実験系の構築が期待できる．我々の開発したデグロン技術が，幅広い分野の研究発展に貢献できればと願っている．