生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

組織の修復能力は臓器ごとに異なる．たとえば，骨格筋では幹細胞である衛星細胞が損傷時に活性化し，新たな筋細胞を供給することで効率的な再生が可能である．一方，哺乳動物の中枢神経系では，海馬の歯状回や側脳室下帯などの領域を除き，成体における神経幹細胞の存在はきわめて限られている．そのため，神経細胞が一度失われると基本的には補充されることがなく，外傷，脳梗塞，神経変性疾患などによる損傷後の回復は困難であり，日常生活に重大な支障をもたらす．このような特性をもつ中枢神経系では，損傷後に生き残った神経細胞をいかに保護し，機能を維持・回復させるかが重要な課題となる．そのカギを握るのが反応性アストロサイトによる神経保護機構であり，近年，後遺症の軽減や機能回復を目的とした創薬ターゲットとしても注目されている．

中枢神経系に存在するグリア細胞の一種であるアストロサイトは，恒常性の維持や環境変化への適応において重要な役割を果たす．通常，アストロサイトは神経伝達物質の取り込み・代謝，エネルギー供給，血液脳関門の維持などを担うが，損傷時や病的状態では形態や機能が変化した「反応性アストロサイト」として，通常とは異なる役割を担うようになる．近年の包括的なトランスクリプトーム解析により，反応性アストロサイトは状況に応じて異なる遺伝子発現パターンを示し，多様な機能を発揮することが明らかになってきた^{1, 2）}．特に，損傷領域のストレス環境に抵抗性を示し，神経細胞を保護する役割を担う反応性アストロサイトの機能とその制御メカニズムを解明することは，中枢神経系の機能維持を目的とする治療戦略の開発につながる可能性がある．

本稿では，脳損傷時における反応性アストロサイトの機能に焦点を当て，特にWnt5a–Ror2シグナルによる機能制御の時空間動態と神経保護に果たす役割について詳述する．

反応性アストロサイトはグリア線維性酸性タンパク質（glial fibrillary acidic protein：GFAP）の発現増加や突起および細胞体の肥大化を特徴とし，免疫組織学的手法によりさまざまな病的状況下で検出される．また，アストロサイトは通常，細胞周期の静止期にあり，増殖を停止しているが，脳および脊髄の損傷時に誘導される反応性アストロサイトは増殖を開始する^3）．したがって，増殖は反応性アストロサイトの特徴の一つであるが，増殖性反応性アストロサイトの出現は，病的状況の種類や局所的な微小環境に依存し，時空間的にも制御されている（図1）．

図1 Ror2発現反応性アストロサイトによる瘢痕形成

健常な脳では，アストロサイトにRor2の発現は認められない（青色）．脳損傷後，損傷部ではミクログリアやマクロファージ（紫色）が活性化し，炎症が引き起こされる．その周囲では，広範囲にわたるアストロサイトでGFAPの発現が上昇する（赤色）．さらに，損傷部近傍の反応性アストロサイトではRor2の発現が誘導される（緑色）．Ror2発現反応性アストロサイトは増殖し，形態を変化させて再配置することで炎症細胞を取り囲み，損傷を免れた神経細胞が存在する領域への炎症細胞の拡大を防ぐ．

脳および脊髄の損傷部位では，損傷後数時間以内にミクログリアや血中由来のマクロファージが集積し，活性化することで炎症を引き起こしながら，死細胞や細胞断片の除去に寄与する．この炎症細胞が集積する損傷中心部の周囲には，生き残った神経細胞およびアストロサイトが存在し，炎症が進行すると，これらのアストロサイトはGFAPの発現が増加した反応性アストロサイトへと変化する（図1）．さらに，数日後には，反応性アストロサイトの中でも特に損傷部近傍の細胞が増殖を開始する．増殖性反応性アストロサイトは形態変化を伴いながら再配置され，密なネットワークを形成し，炎症細胞を隔離するための境界を作る^4）（図1）．この構造はグリア性瘢痕と呼ばれ，中枢神経系の損傷後に特徴的に形成される．

グリア性瘢痕はながらく，軸索再生や神経回路の再構築を阻害する要因と考えられてきた．しかし，増殖性反応性アストロサイトを遺伝学的に除去すると，瘢痕形成は阻害されるものの，軸索の再伸長は促進されず，むしろ損傷を免れた神経細胞が傷害を受け，二次性損傷が拡大することが示されている^{5, 6）}．したがって，増殖性反応性アストロサイトによる瘢痕形成は，損傷後の中枢神経系を保護する重要な役割を担っている．

著者らは，脳損傷時に誘導されるGFAP強陽性の反応性アストロサイトの中でも増殖を開始した細胞でRor2の発現が上昇することを見いだした^7）（図1）．Ror2はWntファミリータンパク質の一つであるWnt5aの受容体であり，胚発生や組織形成において重要な役割を果たしている^8）．Ror2は胎生初期の大脳皮質神経幹細胞に高発現しており，Wnt5a–Ror2シグナルは神経幹細胞の増殖能と神経細胞への分化能を維持する働きを持つ^9）．しかし，神経幹細胞の分化が進むとRor2の発現は低下し，成体脳では通常，ほとんど発現していない．一方，Wnt5aは損傷の有無にかかわらず成体脳内のアストロサイトで恒常的に発現しているため，損傷時に反応性アストロサイトでRor2の発現が上昇することで，恒常的に発現するWnt5aと結合し，Wnt5a–Ror2シグナルが活性化すると考えられる．

Wntシグナルはβ-カテニン依存的シグナル経路（古典的経路）とβ-カテニン非依存的シグナル経路（非古典的経路）に大別される．主な働きとして，古典的経路はCyclin D1やc-Mycなどの遺伝子発現制御を介して細胞増殖を促進し，非古典的経路は低分子量Gタンパク質であるRhoおよびRacの活性化などを介して極性形成や細胞運動を制御することが示されている．Wnt5a–Ror2シグナルは非古典的経路を活性化することが知られているが，細胞増殖の制御にどのように関与するかは十分に解明されていなかった．著者らは，NIH/3T3細胞を用いた解析から，Ror2シグナルがAktを介してforkhead box O3a（FoxO3a）を不活性化し，サイクリン依存性キナーゼインヒビターであるp21CIP1とp27KIP1の発現を低下させることでE2F transcription factor 1（E2F1）の転写活性を促進することを見いだした^10）．E2F1は増殖因子刺激により活性化され，細胞周期のG0/G1期からS期への進行を促進する働きを持つ．実際に，Ror2の発現を抑制したNIH/3T3細胞および培養アストロサイトでは，増殖因子刺激による細胞周期の進行が著しく遅延した^{7, 10）}．また，アストロサイト特異的Ror2ノックアウトマウスでは，脳損傷後の反応性アストロサイトの増殖が有意に低下することが示された^7）．以上の結果から，Ror2は損傷脳内における反応性アストロサイトの増殖制御に重要な役割を担っていることが明らかになった．

損傷脳内では，basic fibroblast growth factor（bFGF）やheparin-binding EGF-like growth factor（HB-EGF）など，アストロサイトの増殖促進活性を持つ液性因子が産生される．静止期の初代培養アストロサイトをこれらの増殖因子で刺激すると，細胞周期が再開されるとともにRor2の発現が上昇することが示された^7）．この際，シングルセルレベルでの観察から，Ror2 mRNAの発現上昇は増殖を開始した細胞に限定されており，Ror2の発現は細胞周期の進行と連動して上昇することが示唆された．さらに，E2F1を人為的に活性化することで，増殖因子の刺激なしでもRor2の発現が誘導されることが明らかとなった^10）．この際，Ror2プロモーターにはE2F1が直接結合することが確認され，E2F1がRor2の転写を促進する転写因子として機能することが示された^10）．前節で述べたように，Ror2シグナルはE2F1の転写活性を促進する働きを持つことから，Ror2シグナルとE2F1の活性化は相互に促進し合う正のフィードバック機構を形成していると考えられる．

損傷脳内では，活性化ミクログリアが主にtumor necrosis factor-α（TNF-α）を，活性化マクロファージが主にinterleukin-1β（IL-1β）を産生し，反応性アストロサイトの機能制御に関与することが示されている^11）．著者らは，TNF-αおよびIL-1βが，増殖因子（bFGFやHB-EGF）によるE2F1の転写活性を増強し，これによりRor2の発現がさらに促進されることを明らかにした^12）（図2A）．この炎症性サイトカインによるE2F1活性の増強には，ヒストンアセチルトランスフェラーゼ複合体のコアタンパク質であるE1A binding protein p400（Ep400）が関与していた^12）．Ep400はRor2プロモーター領域のヒストンアセチル化を促進し，クロマチン構造を緩めることでE2F1の結合を安定化させると考えられる（図2A）．実際に，ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を用いた処理により，bFGF刺激によるRor2の発現誘導が増強されることが確認された^7）．

図2 Wnt5a–Ror2–Nrf2シグナルの活性化による酸化ストレス防止機構

（A）脳損傷部周囲のアストロサイトでは，bFGFやHB-EGFなどの増殖因子が産生され，これによりE2F1が活性化される．また，ミクログリアやマクロファージ由来のTNF-αおよびIL-1 βがE2F1の活性化をさらに促進する．活性化されたE2F1はRor2プロモーターに結合し，Ror2の転写を誘導する．この過程には，Ep400によるヒストンアセチル化が関与している．（B）アストロサイトはWnt5aを発現しており，Ror2発現が上昇した反応性アストロサイトでは，Wnt5a–Ror2シグナルが活性化される．このシグナルによって，p62がリン酸化され，安定化する．リン酸化されたp62はKeap1からNrf2を解離させ，その結果，Nrf2は核内に移行し，酸化ストレス防御遺伝子群を誘導する．（C）損傷脳内で産生されたヘミンおよびその分解産物であるFe^2＋は脂質過酸化を引き起こし，細胞傷害を促進する（赤色の矢印）．Ror2–Nrf2シグナルが活性化した反応性アストロサイトでは，酸化ストレス防御遺伝子群の発現上昇によりヘミンの傷害作用が抑制される（青色の矢印）．この過程では，ヘムオキシゲナーゼがヘミンの分解を促進し，フェリチンはFe^2＋をFe^3＋へと変換して貯蔵する．さらに，シスチン輸送体とグルタチオン合成酵素がグルタチオン合成を促進し，過酸化脂質を除去する．

脳損傷領域に存在する反応性アストロサイトは，虚血再灌流で起こる酸化ストレスや溶血により放出された強い細胞傷害性をもつ血液成分にさらされるため，これらのストレスに対する抵抗性を獲得していると考えられる．RNA-Seqによる網羅的な遺伝子発現解析の結果，増殖因子と炎症性サイトカインの刺激を同時に受けたアストロサイトでは，Ror2に加えて，heme oxogenase-1（HO-1）やferritin light chain 1（Ftl1）を含む酸化ストレス防御遺伝子群の発現が著しく増加していた^12）．これらの遺伝子はE2F1の標的ではなく，ストレス応答転写因子であるnuclear factor erythroid 2-related factor 2（Nrf2）の標的として知られている．詳細な解析により，Wnt5a–Ror2シグナルが，細胞周期の進行制御とは別に，Nrf2の核内蓄積を促進することが明らかとなった^12）（図2B）．

Nrf2の活性化には，活性酸素種（reactive oxygen species：ROS）依存的およびROS非依存的なメカニズムが存在する^13）．通常，Nrf2はkelch-like ECH-associated protein 1（Keap1）と結合しており，ユビキチン化を介して分解される．しかし，ROSが増加すると，Keap1のシステイン残基が酸化され，構造変化を引き起こす．その結果，Nrf2がKeap1から解離し，核内で酸化ストレス防御遺伝子群の転写を促進する．一方，反応性アストロサイトでは，ROS産生とは独立して，Wnt5a–Ror2シグナルがNrf2の活性化を維持する役割を果たす．このメカニズムでは，Wnt5a–Ror2シグナルがp62（Sequestosome 1, SQSTM1とも呼ばれる）のリン酸化と安定化を促進し，これによりp62がKeap1からNrf2を解離させ，Nrf2の核内蓄積を促す^12）（図2B）．このシグナル伝達機構は，E2F1を介したRor2の発現制御を通じてNrf2依存的な酸化ストレス応答を強化し，反応性アストロサイトの酸化ストレス耐性向上に寄与すると考えられる．

二次性損傷とは，受傷後に起こる血腫や浮腫，炎症反応，血液循環不全などにより神経細胞の損傷が拡大する現象であり，二次性損傷の抑制は後遺症の軽減につながる．中でも血管損傷に伴い脳内へ漏出するヘモグロビン由来のヘミンは強い酸化ストレスを誘導し，二次性損傷の主要因となる^14）．ヘミンは膜親和性が高く，細胞膜に蓄積して脂質過酸化を引き起こし，細胞傷害を促進する．さらに，ヘミンが分解する過程で遊離するFe^2＋は，フェントン反応を介してヒドロキシラジカルを生成し，酸化ストレスを増幅させる．

損傷脳内における反応性アストロサイトの増殖は，特に血管の近傍で顕著に認められ，血管損傷と密接に関連していることが示唆されている^6）．Ror2の発現を抑制したアストロサイトをヘミンで処理すると，細胞内のFe^2＋と脂質過酸化が増加し，細胞死が顕著に進行することが確認されたことから^12），増殖性反応性アストロサイトにおけるRor2–Nrf2シグナルの活性化は，ヘミンによる酸化ストレス傷害に対する抵抗性の獲得に寄与することが示唆される（図2C）．

興味深いことに，反応性アストロサイトにおけるRor2–Nrf2シグナルの活性化は，血管修復の過程と時間的に一致して変動する．コラゲナーゼ投与による脳内出血モデルマウスにおいて，Ror2の発現上昇およびNrf2の活性化は，損傷5日目ごろをピークに14日目ごろにはほぼ基底レベルに戻る^12）．この時期は血管外漏出物のクリアランスおよび血管修復が進行する過程と対応しており，Ror2–Nrf2シグナルが血管損傷後の二次性損傷防止に重要な役割を果たしていることが示唆される．

損傷後5日目において，損傷部位を取り囲むRor2陽性反応性アストロサイトの周りには生存した神経細胞が多数存在する^12）．このことから，Ror2陽性反応性アストロサイトは酸化ストレスへの抵抗性を獲得するとともに，周囲の神経細胞の生存促進にも寄与する可能性がある．実際に，脳内出血モデルマウスにおいて，アストロサイト特異的にRor2の発現を抑制すると，脳内出血後の損傷領域が拡大する^12）．一方，Wnt5aを強制発現させてRor2–Nrf2シグナルを増強すると，損傷領域の縮小が確認された^12）．これらの結果から，反応性アストロサイトにおけるWnt5a–Ror2–Nrf2シグナルは，二次性損傷の抑制に寄与する重要な経路であることが示唆される．

本稿では，Wnt5a–Ror2シグナルが損傷脳内の反応性アストロサイトにおいて時空間的に活性化されるメカニズムと，それが二次性損傷防止に果たす役割について概説した．Wnt5a–Ror2シグナルは，増殖性反応性アストロサイトにおいて活性化され，酸化ストレス耐性を強化するとともに，ヘミンを取り込み分解することで脳内のヘミン濃度を低下させ，神経細胞傷害を軽減するものと考えられる．加えて，反応性アストロサイトは神経栄養因子の産生を通じて神経細胞の生存をサポートし，シナプス形成および血管新生の促進にも寄与することで，組織修復を促すことも知られている．これらの過程におけるWnt5a–Ror2シグナルの関与は未解明な部分が多く，さらなる研究が必要である．

一方で，反応性アストロサイトが産生する超長鎖脂肪酸が神経細胞やオリゴデンドロサイトに対して傷害を与えることが報告されており^15），特定の条件下では，反応性アストロサイトの機能が病態を悪化させる可能性がある．これらの点を踏まえると，反応性アストロサイトが示す多様な機能の制御メカニズムを解明し，その環境や状況に応じた役割を明らかにすることが今後の課題である．